NGS二代測序相關(guān)技術(shù)知多少
NGS，或者是二代測序（當(dāng)然還有三代測序、四代測序）這幾個(gè)詞，相信大家就算未接觸過，也已經(jīng)聽過，NGS到底是做什么呢？或者說，NGS到底研究的是什么？在這里，我們來詳細(xì)講解講解吧。
二代測序相關(guān)的技術(shù)可以分為三大類，DNA研究相關(guān)技術(shù)、RNA研究相關(guān)技術(shù)和表觀研究相關(guān)技術(shù)（我們主要來給大家講述下二代測序相關(guān)的技術(shù)，誰讓目前屬二代測序相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用最多呢）。
圖：NGS測序圖鑒
1、DNA研究相關(guān)技術(shù)
DNA相關(guān)研究技術(shù)主要步驟離不開：DNA提取、DNA片段化、DNA文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析。
看起來，DNA相關(guān)研究技術(shù)操作步驟似乎沒有那么難，那么，如果你覺得DNA研究很簡單的話，那你就真是too young too simple啦。
首先，DNA研究相關(guān)技術(shù)里，全基因組測序WGS是逃脫不開的技術(shù)，從人類基因組計(jì)劃實(shí)施完成之后，人類開始進(jìn)入了基因組時(shí)代，不同物種的基因組信息被相繼報(bào)道，關(guān)于基因組的生信分析手段也層出不窮，要來講基因組的故事，可能得講述個(gè)“兩三百年”了，所以這里，我們就不去贅述它。但是大家要知道，所有的關(guān)于二代測序研究，在進(jìn)入這個(gè)領(lǐng)域之前，我們還是要去確認(rèn)下所要研究的物種是否有基因組，當(dāng)然了，這里可能會有些杠精默默吐槽，無參分析現(xiàn)在都可以做的。嗯，我知道啊，但是無參分析從來也只是不得已而為之，在有參考序列時(shí)，盡量選擇用有參的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
在基因組測序上，還有全基因組重測序和簡化基因組測序，這類技術(shù)目前主要應(yīng)用與構(gòu)建遺傳圖譜、種質(zhì)資源鑒定、動(dòng)植物遺傳育種、結(jié)構(gòu)變異檢測、性狀基因定位和群體進(jìn)化分析等，衍生了一些分析的專有名稱如BSA、SNP、Indel、SV、QTL、GWAS等，都是在根據(jù)不同的樣本數(shù)量及分析需求進(jìn)行調(diào)整。除此之外，還有一些做環(huán)境樣本如土壤、糞便、腸道和水體等或者病原樣本的宏基因組的，也是基于單個(gè)樣本基因組研究技術(shù)發(fā)展起來的。當(dāng)然，還有一些基于群體的但是研究的是某個(gè)或者某些基因部分序列的技術(shù)如DNA條形碼、宏條形碼等或者是16S/18S/ITS測序、功能基因組測序、食性分析等擴(kuò)增子測序。
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
規(guī)格 |
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機(jī)械法建庫 |
12199ES24/96 |
24/96 T |
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12201ES24/96 |
24/96 T |
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酶切法建庫 |
12205ES24/96 |
24/96 T |
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機(jī)械法建庫 |
13311ES16/96 |
16/96 T |
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酶切法建庫 |
13322ES16/96 |
16/96 T |
2、RNA研究相關(guān)技術(shù)
RNA相關(guān)研究技術(shù)的主要步驟也是一樣，離不開RNA提取、ｍRNA捕獲（ｒRNA去除）、RNA文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析。
RNA研究目前主要的研究對象是ｍRNA、miRNA、circRNA、lncRNA以及tRNA。根據(jù)研究對象的特性，建庫的方法也不相同。比如mRNA有polyA尾，所以使用oligo dT beads捕獲ployA；而miRNA因?yàn)槠屋^小，通常用非變性膠跑膠檢測后切膠回收，circRNA建庫分兩種情況，一種是只構(gòu)建circRNA的文庫，這種時(shí)候，需要先去除線性化的RNA，再來構(gòu)建circRNA的文庫，當(dāng)然，還有另外一種就是用去除rRNA的方式構(gòu)建lncRNA文庫，這樣既能夠得到mRNA信息、lncRNA的信息，還能得到部分circRNA；研究tRNA呢，得特異性捕獲tRNA得發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后加上去甲基化得步驟，之后構(gòu)建tRNA文庫。
在這里，要來講一個(gè)特殊的轉(zhuǎn)錄組研究，就是單細(xì)胞RNA-seq，單個(gè)細(xì)胞因?yàn)镽NA量少，使用常規(guī)的建庫方法通常容易失敗。這時(shí)，我們需要讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)盡量在一管中實(shí)驗(yàn)，而不是常規(guī)的需要在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中需要不斷的更換EP管。目前，大多采用的是磁珠來實(shí)現(xiàn)一管操作。因?yàn)榻◣鞎r(shí)，通常構(gòu)建的是mRNA文庫。
Smart-seq2實(shí)驗(yàn)流程【1】
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
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mRNA常規(guī)文庫和RNA鏈特異文庫 |
Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® 雙模式mRNA建庫試劑盒 |
12301ES24/96 |
24/96 T |
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Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI® 雙模式mRNA 建庫試劑盒 |
13330ES24/96 |
24/96 T |
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LncRNA+mRNA常規(guī)文庫及鏈特異文庫 |
Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina® |
12252ES24/96 |
24/96 T |
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13333ES24/96 |
24/96 T |
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一步法RNA建庫試劑盒（含人rRNA去除試劑） |
Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina® 極速RNA 建庫試劑盒 |
12304ES24/96 |
24/96 T |
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單細(xì)胞RNA文庫構(gòu)建 |
Hieff NGS® Single Cell/Low Input cDNA Synthesis & Amplification Module |
12500ES24/96 |
24/96 T |
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Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng) |
12206ES24/96 |
24/96 T |
3、表觀組學(xué)相關(guān)技術(shù)
表觀組學(xué)主要研究的是核酸不發(fā)生變化，但是表型發(fā)生變化的機(jī)制。目前表觀組學(xué)研究分為四大部分：甲基化研究、組蛋白修飾研究、染色質(zhì)重塑研究以及非編碼RNA調(diào)控研究。而這中間涉及的技術(shù)類型非常的多。
圖：表觀遺傳調(diào)控圖鑒
3.1 甲基化研究
甲基化研究分兩大類，一類是DNA甲基化，一類是RNA甲基化。DNA甲基化目前研究的是5mC和6mA兩大修飾類型，而5mC研究的技術(shù)類型有WGBS、RRBS、oxBS、meDIP-seq和hmeDIP-seq，6mA研究的技術(shù)類型有6mA-IP-seq。RNA甲基化研究也是有5mc和6mA，使用的技術(shù)也是meDIP和meRIP。
不同的甲基化研究技術(shù)，使用的不同的技術(shù)原理。WGBS主要是通過使用亞硫酸鹽處理后，非甲基化的C堿基被轉(zhuǎn)化成U，之后在PCR擴(kuò)增中被轉(zhuǎn)化成T。這種方法是最經(jīng)典的全基因組甲基化研究方法，也是甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)，能得到全基因組范圍內(nèi)的甲基化修飾情況。RRBS主要是利用甲基化敏感性酶來對基因組DNA進(jìn)行酶切，捕獲的區(qū)域主要是CpG島。OxBS技術(shù)主要是研究羥甲基化修飾。在實(shí)驗(yàn)過程中，需要構(gòu)建兩個(gè)文庫，一個(gè)是常規(guī)的WGBS，另一個(gè)文庫先通過酶來轉(zhuǎn)化甲基化修飾狀態(tài)的中間態(tài)，即通過酶氧化將5hmC氧化成5fc，之后亞硫酸鹽處理時(shí)，這些甲基化中間狀態(tài)都能被轉(zhuǎn)化成U，然后通過生信的方法來進(jìn)行換算。另外一大類就是使用特異性抗體來進(jìn)行靶向捕獲，比如meDIP、hmeDIP和6mA-IP-seq以及meRIP。
3.2 組蛋白修飾研究
組蛋白修飾的研究，主要是研究各種不同的組蛋白修飾參與的染色質(zhì)調(diào)控和基因的表達(dá)調(diào)控。研究的技術(shù)是以ChIP-seq為代表的DNA與蛋白互作的技術(shù)。這些技術(shù)類型有ChIP-seq、CUT&RUN和CUT&tag。
3.3 染色質(zhì)重塑研究
染色質(zhì)重塑研究，主要是研究染色質(zhì)重塑因子的染色質(zhì)調(diào)控和基因表達(dá)調(diào)控。研究的技術(shù)類型與組蛋白修飾一致，也是ChIP-seq、CUT&RUN和CUT&tag。
圖：DNA-蛋白互作技術(shù)流程
除了以上介紹的這些DNA-蛋白互作技術(shù)外，還有DAP-seq，也是研究DNA-蛋白互作，但是屬于體外實(shí)驗(yàn)，適合一些非模式物種的DNA-蛋白互作研究，該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)就是無需抗體，也無需轉(zhuǎn)基因體系，但是因?yàn)槭求w外實(shí)驗(yàn)，容易產(chǎn)生很多假陽性。
圖：DAP-seq實(shí)驗(yàn)流程[2]
還有染色質(zhì)開放性研究技術(shù)ATAC-seq，它主要是利用tn5酶來切割染色質(zhì)開放區(qū)域，之后對這些開放區(qū)域DNA進(jìn)行建庫后分析。
圖：ATAC-seq建庫流程[3]
3.4 非編碼RNA調(diào)控
非編碼RNA調(diào)控，除了有常規(guī)的RNA建庫外，還有RNA-蛋白互作技術(shù)研究。最經(jīng)典的研究就是關(guān)于RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的研究。主要是通過RNA pull down及RIP-seq/CLIP/miCLIP/eCLIP等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)研究目的。
RNA pull down主要是通過用已知的RNA來pull 未知的互作蛋白，對拉取下來的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。而RIP/CLIP/miCLIP/eCLIP主要是用已知的RNA結(jié)合蛋白來調(diào)取互作的RNA。通常，我們可以選擇RNA pull down和RIP/CLIP/miCLIP/eCLIP同時(shí)進(jìn)行，對需要驗(yàn)證的RNA和RBP進(jìn)行正向和反向驗(yàn)證。
圖：eCLIP實(shí)驗(yàn)流程【4】
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
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先轉(zhuǎn)化后建庫試劑盒 |
12211ES24/96 |
24/96 T |
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機(jī)械法建庫 |
12199ES24/96 |
24/96 T |
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酶切法建庫 |
12204ES24/96 |
24/96 T |
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適用2000以下細(xì)胞起始量的ATAC文庫構(gòu)建 |
Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng) |
12206ES24/96 |
24/96 T |
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適用104-105細(xì)胞起始量的ATAC文庫構(gòu)建 |
Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 50 ng) |
12207ES24/96 |
24/96 T |
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CUT&Tag建庫試劑盒 |
Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® |
12598ES04/12/48 |
4 T/12 T/48 T |
其他模塊
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
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短接頭-雙端index |
Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 1/Set 2（96 種） |
12412ES02 |
96×2 T |
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長接頭-單端index |
13519ES04/16 13520ES04/16 |
48×4 T/16 T |
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UDI接頭-雙端index |
12404ES01 12405ES01 |
12×2 T |
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單端barcode長接頭-MGI |
13360ES02/04/96 13361ES02/04/96 13362ES02/04/96 |
8×2/4 /100 T |
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短接頭+UMI UDB primer-MGI |
13367ES02/04 13368ES02/04 |
48×2 T/4 T |
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短接頭+UDB primer-MGI |
13451ES02/04 13452ES02/04 13453ES02/04 13454ES02/04 |
48×2 T/4 T |
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DNA純化 |
12601ES |
/ |
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DNA連接酶 |
10298ES40/42 |
40/400 KU |
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長接頭-單端index |
13519ES04/16 13520ES04/16 |
48×4 /16 T |
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接頭-雙端index |
12414ES02 |
96×2 T |
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短接頭+CDI primer-RNA-MGI |
13365ES02 13366ES02 |
96×2 T |
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接頭 |
12610ES |
96 index |
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含DNA片段化、末端修復(fù)及加A步驟所有模塊 |
Hieff NGS® OnePot Pro DNA Fragmentation Reagent 快速片段化/末端修復(fù)/A尾添加模塊 |
12619ES24/96 |
24 T/96 T |
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片段化后的DNA末端修復(fù)及加A步驟所有模塊 |
Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module 快速末端修復(fù)/A尾添加模塊 |
12608ES24/96 |
24 T/96 T |
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DNA連接酶 |
10298ES40/42 |
40/400 KU |
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核糖體RNA去除試劑盒（人/小鼠/大鼠） |
12253ES24/96 |
24 T/96 T |
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rRNA去除試劑盒（植物） |
12254ES24/96 |
24 T/96 T |
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核糖體RNA去除試劑盒（Human rRNA & ITS/ETS） |
12257ES24/96 |
24 T/96 T |
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人珠蛋白去除探針 |
12806ES24/96 |
24/96 T |
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一步法rRNA去除（人） |
12258ES24/96 |
24/96 T |
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一步法rRNA去除（人） |
12259ES24/96 |
24/96 T |
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一步法人珠蛋白去除（人） |
12260ES24/96 |
24/96 T |
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高效保真的耐U堿基的DNA擴(kuò)增酶 |
10145ES60/76 |
100 /500 U |
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文庫擴(kuò)增酶模塊 |
12620ES24/96/97 |
24/96/400 T |
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2×Super Canace® Ⅱ High-Fidelity Mix for Library Amplification |
12621ES24/96 |
24 T/96 T |
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12624ES24/96 |
24 T/96 T |
參考文獻(xiàn)：
[1] Picelli S , Faridani O R , Bjrklund S K , et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols, 2014, 9(1):171-181.
[2]Ecker, Joseph, R, et al. Mapping genome-wide transcription-factor binding sites using DAP-seq[J]. Nature Protocols Erecipes for Researchers, 2017.
[3] Buenrostro J D , Wu B , Chang H Y , et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[J]. Current Protocols in Molecular Biology, 2015, 109(1).
[4] Nostrand E L V , Pratt G A , Shishkin A A , et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP)[J]. Nature Methods.
