Hieff NGS^® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina®測(cè)序平臺(tái)的RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，包含宿主（人）rRNA去除試劑，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)ds-cDNA合成試劑，轉(zhuǎn)座酶和優(yōu)化的緩沖體系，以及文庫(kù)擴(kuò)增試劑。本產(chǎn)品利用專業(yè)開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的新一代轉(zhuǎn)座酶可以完成5~10 ng ds-cDNA建庫(kù)，簡(jiǎn)化了操作流程，將建庫(kù)時(shí)間縮短到3 h。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于多種臨床樣本的建庫(kù)。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，不同GC含量的樣本，均可獲得優(yōu)異的測(cè)序結(jié)果，文庫(kù)覆蓋度高，均一性好，偏好性低，使建庫(kù)變得更加簡(jiǎn)單高效。提供的所有試劑都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最大程度上保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)和名稱			12304ES08	12304ES24	12304ES96
12304-A		Random Primer & rRNA Removal Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12304-B		1st Reaction Buffer	64 μL	192 μL	768 μL
12304-C		1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12304-D		2nd Reaction Buffer	56 μL	168 μL	672 μL
12304-E		2nd Strand Enzyme Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12304-F		5×Reaction Buffer	32 μL	96 μL	384 μL
12304-G		Transposome Mix V1	40 μL	120 μL	480 μL
12304-H		PCR Primer Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12304-I		2×Ultima Amplification Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12304-J		N5 (N501)*	8 μL	——	——
12304-K		N7 (N701)*	4 μL	——	——
12304-L		N7 (N702)*	4 μL	——	——

 

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4. 請(qǐng)使用無(wú)RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

6. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關(guān)于產(chǎn)品原理

本產(chǎn)品基于轉(zhuǎn)座酶法開(kāi)發(fā)，其核心原理是轉(zhuǎn)座酶及其轉(zhuǎn)座機(jī)制。在 Transposome Mix 中包含由轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構(gòu)成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座發(fā)生時(shí)，該轉(zhuǎn)座子將 Adapter 1 和 Adapter 2 接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有 Adapter 2 的 DNA，之后利用DNA聚合酶將轉(zhuǎn)座形成的切口補(bǔ)齊。這種產(chǎn)物經(jīng) N5 (N5XX)和N7 (N7XX)以及 P5 和 P7 (PCR Primer Mix)兩對(duì)引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測(cè)序文庫(kù)。

 

圖1   Transposome的工作原理

三、關(guān)于ds-cDNA的片段化

1. 本試劑盒適用5~10 ng Input ds-cDNA。在 Input ds-cDNA 投入前，使用基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法，如 Qubit® ，PicoGreen®等進(jìn)行定量?！咀ⅲ篢ransposome Mix 對(duì) DNA 濃度非常敏感，所以準(zhǔn)確的 DNA 濃度測(cè)定對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否至關(guān)重要。】

四、DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建庫(kù)過(guò)程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop®等。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

六、自備材料 (Other Material)

1. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。

2. N5 (N5XX)和N7 (N7XX) Index引物：Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index) (Cat#12610ES96)。

3. 文庫(kù)質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫(kù)定量試劑。

4. 其他材料：無(wú)水乙醇、無(wú)菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

 

建庫(kù)流程

 

 

圖2 極速 RNA建庫(kù)操作流程

 

使用方法

Step 1 宿主rRNA的去除

1. 將 Random Primer & rRNA Removal Mix室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。按照下表配置反應(yīng)液：

表1 宿主rRNA去除反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Random Primer & rRNA Removal Mix	2
RNA (10 ng~500 ng)	13
Total	15

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表2所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行RNA的預(yù)變性。

表2 宿主rRNA去除反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋 105°C	On
85°C	5 min
72°C	2 min
60°C	10 min
立即置于冰上	3 min

Step 2 第一鏈cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，室溫解凍，顛倒混勻后瞬離。按表6所示，配制第一鏈cDNA合成的反應(yīng)液。

表3 第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
變性的RNA	15
1st Reaction Buffer	8
1st Strand Enzyme Mix	2
Total	25

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表4所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表4第一鏈cDNA合成反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋 105°C	On
25°C	5 min
42°C	30 min
85°C	5 min
4°C	Hold

Step 3第二鏈cDNA的合成 (2nd Strand Synthesis)：

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表5所示，配制第二鏈cDNA合成反應(yīng)液。

表5 第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
1st Strand cDNA	25
2nd Reaction Buffer	7
2nd Strand Enzyme Mix	3
Total	35

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表6所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表6 第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋	Off
16°C	30 min
4°C	Hold

 

Step4 cDNA產(chǎn)物純化 (Post Ligation Clean Up)

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取21 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至第二鏈cDNA產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入14 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取12 μL上清至新PCR管中，取1 μL的純化測(cè)第二鏈cDNA產(chǎn)物進(jìn)行Qubit 定量，進(jìn)行轉(zhuǎn)座酶的片段化。

Step 5 DNA片段化 (DNA Tagment)

1. 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer 室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌 PCR 管中配制表 7 所示反應(yīng)體系。

表7 片段化反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
2nd Strand cDNA純化產(chǎn)物	5~10 ng
5×Reaction Buffer	4
Transposome Mix V1	5
ddH2O	Up to 20

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表8所示反應(yīng)程序，進(jìn)行DNA片段化，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng)。

表8 片段化的反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋105°C	on
55°C	10 min
4°C	Hold

Step 6 文庫(kù)擴(kuò)增 (Library Amplification)

該步驟將對(duì)純化或長(zhǎng)度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表8中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表9所示反應(yīng)體系。

表9  文庫(kù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系

組分名稱	體積 (μL)
片段化產(chǎn)物	20
PCR Primer Mix	3
N5XX*	1
N7XX*	1
2×Ultima Amplification Mix	25
Total	50

【注】：*Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表10示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表10  文庫(kù)擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
72°C	3 min	1*
95°C	1 min	1
95°C	10 sec	13~15 cycles**
55°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	-

【注】：*此步不可省略。轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物并非完整的雙鏈 DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循環(huán)數(shù)請(qǐng)根據(jù)測(cè)序需要進(jìn)行選擇。起始 DNA 量為 5-10 ng 時(shí)，推薦 13-15 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

Step 7 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化 (Post Amplification Clean Up)

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至PCR產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行文庫(kù)定量、質(zhì)檢。

Step 8 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見(jiàn)注意事項(xiàng)五。

附錄

使用Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®對(duì)50 ng ~500 ng 293 RNA樣本建庫(kù)，使用0.9×磁珠進(jìn)行PCR后純化，結(jié)果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)。

 

圖3 極速 RNA建庫(kù)峰圖

 

 

HB220117