產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品簡介
Hieff NGS ® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)利用RNase H消化法去除人、小鼠和大鼠來源總RNA
中的核糖體 RNA 和 45S ITS/ETS 區(qū)域以保留信使 RNA (mRNA)和其它非編碼 RNA。該試劑盒對于完整和部分降解的總 RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA 去除效果。由于降解的FFPE樣本相比新鮮組織樣本通常含有較高比例的ITS/ETS， 該試劑盒人、小鼠和大鼠 45S ITS/ETS 區(qū)域的探針，經(jīng)該試劑盒去除后可顯著提高測序結(jié)果中有效數(shù)據(jù)比例。
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
12257ES12 |
12257ES24 |
12257ES96 |
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12257-A |
● |
Hybridization Buffer |
36 μL |
72 μL |
288 μL |
|
12257-B |
● |
Human Probe Mix (rRNA & ITS/ETS) |
24 μL |
48 μL |
192 μL |
|
12257-C |
● |
RNase H Buffer |
36 μL |
72 μL |
288 μL |
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12257-D |
● |
RNase H |
192 μL |
192 μL |
192 μL |
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12257-E |
● |
DNase I Buffer |
330 μL |
660 μL |
2×1320 μL |
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12257-F |
● |
DNase I |
30 μL |
60 μL |
240 μL |
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事項
1. 請使用無 RNase 污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進行清理，推薦使用 Thermo Fisher 公司的 RNAZapTM 高效核酸去除噴霧去除 RNA 酶污染。
2. RNA 樣品應(yīng)不含基因組 DNA 污染，若樣品中有 gDNA 殘留，應(yīng)先進行 DNase I 消化并純化后再用于本試劑盒。
3. RNA 樣品最大投入體積為 10 μL，若樣品體積較大，可先進行濃縮。
4. RNase H 消化步驟如需配 Mix 使用，請現(xiàn)配現(xiàn)用；該組分12 T和24 T規(guī)格的裝量會有剩余。
5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
6. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
使用說明
自備材料：
1. RNA純化磁珠：Hieff NGS® Cleaner (Cat#12602)或其他等效產(chǎn)品。
2. qRT-PCR質(zhì)檢rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效產(chǎn)品。
3. 其他材料： 無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。
操作步驟
1. 探針雜交
1.1 將探針和雜交Buffer從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
1.2 準(zhǔn)備RNA樣品：根據(jù)投入量和樣品濃度，計算RNA取樣體積，用Nuclease free H2O稀釋至10 μL。
1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反應(yīng)體系。
表1 探針雜交反應(yīng)體系
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名稱 |
體積 (μL) |
|
Hybridization Buffer |
3 |
|
Human Probe Mix (rRNA&ITS/ETS) |
2 |
|
Total RNA |
10 (100 ng~1 μg) |
|
Total |
15 |
1.4 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
1.5 將上述 PCR 管置于PCR儀中，按照表2所示反應(yīng)程序，進行探針雜交反應(yīng)。
表2 探針雜交反應(yīng)程序
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溫度 |
時間 |
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熱蓋105°C |
On |
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95 °C |
2 min |
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95 °C-22 °C |
0.1 °C/s |
|
22 °C |
5 min |
|
4 °C |
hold |
2. RNase H消化
2.1 將RNase H消化試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表 3 所示，配制RNase H消化反應(yīng)體系。
表3 RNase H消化反應(yīng)體系
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名稱 |
體積 (μL) |
|
RNase H Buffer |
3 |
|
RNase H |
2 |
|
上步產(chǎn)物 |
15 |
|
Total |
20 |
注：RNase H Buffer及RNase H需單獨添加，若因樣本量較多需配置mix，請現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響去除效果。
2.2 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
2.3 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：熱蓋50 °C；37 °C，30 min； 4 °C，hold，進行RNase H消化反應(yīng)。
3. DNase I 消化
3.1 將DNase I消化試劑從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表4所示，配制DNase I消化反應(yīng)體系。
表4 DNase I消化反應(yīng)體系
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名稱 |
體積 (μL) |
|
DNase I Buffer |
27.5 |
|
DNase I |
2.5 |
|
上一步產(chǎn)物 |
20 |
|
Total |
50 |
3.2 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
3.3 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：熱蓋50 °C；37 °C，30 min；4 °C，hold，進行DNase I消化反應(yīng)。
4. RNA純化
4.1 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® RNA Cleaner (Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。
4.2 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
4.3 吸取110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步產(chǎn)物中，移液器充分吹打混勻，室溫孵育 5 min。
4.4 將PCR管置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。
4.5 保持PCR管始終置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。
4.6 重復(fù)步驟 4.5，總計漂洗兩次。用 10 μL移液器吸干凈殘留液體。
4.7 保持PCR 管始終置于磁力架中，室溫下開蓋干燥磁珠 (5~10 min)。
4.8 RNA洗脫：將PCR 管從磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H2O（或使用適合下游實驗的相應(yīng)體積Nuclease free H2O或洗脫緩沖液），使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。
4.9 將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取10 μL上清（可根據(jù)步驟4.7選擇的實際洗脫體積進行相應(yīng)調(diào)整）至新的Nuclease free PCR 管中。
【注】：洗脫后的樣品請立即進行下游實驗，或置于-80 °C存放。
案例展示
不同Human RNA樣本分別不含ITS/ETS去除rRNA、使用含ITS/ETS的Cat#12257去除rRNA及ITS/ETS后銜接RNA建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，經(jīng)測序分析rRNA與ITS/ETS在下機數(shù)據(jù)中的占比。
表：不同RNA質(zhì)量樣本使用含或者不含ITS/ETS探針的測試數(shù)據(jù)展示
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RNA質(zhì)量 |
去除方案 |
Input |
rRNA (%) |
ITS/ETS (%) |
Mapping (%) |
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293T RNA; RIN=10 |
去除rRNA |
1 μg |
0.19 |
4.6 |
98.28 |
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去除rRNA及ITS/ETS |
1 μg |
0.15 |
0.04 |
98.79 |
|
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FFPE RNA |
去除rRNA |
500 ng |
0.23 |
4.75 |
95.35 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
500 ng |
0.21 |
0.02 |
95.42 |
|
|
FFPE RNA |
去除rRNA |
500 ng |
1.4 |
16.28 |
95.57 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
500 ng |
0.56 |
0.11 |
95.51 |
|
|
FFPE RNA |
去除rRNA |
1 μg |
0.35 |
67.61 |
58.4 |
|
去除rRNA及ITS/ETS |
1 μg |
0.79 |
0.84 |
60.35 |
Ver.CN20250307
