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          HieffNGS? Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina?(for 1 ng)
           
          更多活動更多優(yōu)惠，盡在翌圣商城》
           
           
           已下架 
           
          產(chǎn)品說明書
                  
          FAQ
                  
          COA
                  
          已發(fā)表文獻
                  
           
          操作手冊
          


          ATAC實驗操作流程 點擊下載
          


           
          


          產(chǎn)品描述
          


           
          


          Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)是針對lllumina®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的轉(zhuǎn)座酶法建庫試劑盒，適用于1 ng的基因組DNA、cDNA、擴增子（>500 bp）等樣本的建庫。與常規(guī)分步法建庫相比，Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®采用新型轉(zhuǎn)座酶和優(yōu)化的緩沖體系，僅需10 min即可完成DNA片段化、末端修復和接頭連接過程，顯著縮短建庫時間至1.5小時以內(nèi)，并獲得優(yōu)異的測序質(zhì)量。此外，本試劑盒已經(jīng)不同GC含量DNA樣本的驗證，無偏好性或僅具有極低的偏好性。本試劑盒提供的所有試劑盒組分，都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量與功能驗證，最高程度保障產(chǎn)品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。
          


           
          


          產(chǎn)品組分
          


           
          


          
	
		
          
			
			
          組分編號
          
			          		
			
			
          組分名稱
          
			          		
			
			
          8 libraies
          
			          		
			
			
          24 libraies
          
			          		
			
			
          96 libraies
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-A
          
			          		
			
			
          5×Reaction Buffer
          
			          		
			
			
          32 μL
          
			          		
			
			
          96 μL
          
			          		
			
			
          384 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-B
          
			          		
			
			
          Transposome Mix V1
          
			          		
			
			
          40 μL
          
			          		
			
			
          120 μL
          
			          		
			
			
          480 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-C
          
			          		
			
			
          PCR Primer Mix
          
			          		
			
			
          24 μL
          
			          		
			
			
          72 μL
          
			          		
			
			
          288 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-D
          
			          		
			
			
          2×Ultima Amplification Mix
          
			          		
			
			
          200 μL
          
			          		
			
			
          600 μL
          
			          		
			
			
          2×1200 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-E
          
			          		
			
			
          N5 (N501)*
          
			          		
			
			
          8 μL
          
			          		
			
			
          ——
          
			          		
			
			
          ——
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-F
          
			          		
			
			
          N7 (N701)*
          
			          		
			
			
          4 μL
          
			          		
			
			
          ——
          
			          		
			
			
          ——
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          12206-G
          
			          		
			
			
          N7 (N702)*
          
			          		
			
			
          4 μL
          
			          		
			
			
          ——
          
			          		
			
			
          ——
          
			          		
		
          
	          

          


          注意：*測序時Index序列N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA，N702-CGTACTAG。
          


           
          


          運輸與保存方法
          


           
          


          冰袋運輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。
          


           
          


          注意事項
          


           
          


          一、關于操作
          


          1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
          


          2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
          


          3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打或輕輕振蕩混勻，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。
          


          4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。試劑吸取時應保證槍頭適當深入液體，排出時應確認槍頭無殘留。
          


          5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。
          


          6. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
          


          7.本產(chǎn)品僅用作科研用途！
          


          二、關于產(chǎn)品原理
          


          本產(chǎn)品基于轉(zhuǎn)座酶法開發(fā)，其核心原理是轉(zhuǎn)座酶及其轉(zhuǎn)座機制。在Transposome Mix中包含由轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構成一個完整的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座發(fā)生時，該轉(zhuǎn)座子將Adapter 1和Adapter 2接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有Adapter 2的DNA，之后利用DNA聚合酶將轉(zhuǎn)座形成的切口補齊。這種產(chǎn)物經(jīng)N5（N5XX）和N7（N7XX）以及P5和P7（PCR Primer Mix）兩對引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測序文庫。
          


           圖片1.png
          


          圖1  Fast Tagment DNA建庫試劑盒原理
          


          三、關于DNA片段化（DNA Tagment）
          


          1. 本試劑盒使用轉(zhuǎn)座酶進行DNA片段化。如DNA樣品為PCR產(chǎn)物，應保證其長度>500 bp。因轉(zhuǎn)座酶無法作用于DNA末端，因此PCR產(chǎn)物最末端50 bp測序覆蓋度可能會有所降低。我們推薦您在制備PCR產(chǎn)物時將待測區(qū)域兩末端各延長50-100 bp，以避免末端測序覆蓋度降低的情況。
          


          2. 本試劑盒適用1 ng Input DNA。在Input DNA投入前，應將其純化并溶于滅菌蒸餾水中，A260/A280 = 1.8-2.0，并使用基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等進行定量?！咀⒁猓阂?/span>Transposome Mix對DNA濃度非常敏感，所以準確的DNA濃度測定對實驗成功與否至關重要。】
          


          四、關于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）
          


          1. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。
          


          2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
          


          3. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。
          


          4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
          


          5. 磁珠使用過程中，應保證移液準確性。
          


          6. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
          


          7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存1周，-20°C可保存1個月。
          


          五、關于文庫擴增（Library Amplification）
          


          1. 使用本試劑盒必須進行文庫擴增步驟。因轉(zhuǎn)座反應產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA文庫，必須通過PCR反應生成完整的DNA文庫。
          


          2. 當Input DNA量為1 ng時，推薦使用8-15個擴增循環(huán)，13個循環(huán)的文庫產(chǎn)出約為600 ng。
          


          六、關于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）
          


          1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。
          


          2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。
          


          3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。
          


          4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。
          


          5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。
          


           
          


          使用方法
          


           
          


          一、自備材料
          


          1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。
          


          2. 文庫質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。
          


          3. N5（N5XX）和N7（N7XX）Index引物： Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）。
          


          4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
          


          二、操作流程
          


          image.png 
          


           
          


          三、操作步驟
          


          3.1 DNA片段化（DNA Tagment）
          


          1. 準備工作：將Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
          


          2. 于無菌PCR管中配制表1所示反應體系。
          


          表1  片段化反應體系
          


          
	
		
          
			
			
          名稱
          
			          		
			
			
          體積（μL）
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          1 ng Input DNA 
          
			          		
			
			
          x
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          5×Reaction Buffer
          
			          		
			
			
          4
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          Transposome Mix V1
          
			          		
			
			
          5
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          ddH2O
          
			          		
			
			
          Up to 20 μL
          
			          		
		
          
	          

          


          3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。
          


          4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表2所示反應程序，進行片段化反應。
          


           
          


          表2  片段化反應程序
          


          
	
		
          
			
			
          溫度
          
			          		
			
			
          時間
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          熱蓋105°C
          
			          		
			
			
          On
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          55°C
          
			          		
			
			
          10 min
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          4°C
          
			          		
			
			
          Hold
          
			          		
		
          
	          

          


          3.2 文庫擴增（Library Amplification）
          


          1. 提前將表3中的試劑解凍混勻，置于冰上備用。
          


          2. 片段化程序結(jié)束后，立即將PCR管置于冰上配制表3中PCR反應體系。
          


          表3  PCR擴增反應體系
          


          
	
		
          
			
			
          名稱
          
			          		
			
			
          體積（μL）
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          片段化產(chǎn)物
          
			          		
			
			
          20 
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          PCR Primer Mix
          
			          		
			
			
          3 
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          N5XX*
          
			          		
			
			
          1
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          N7XX*
          
			          		
			
			
          1 
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          2×Ultima Amplification Mix
          
			          		
			
			
          25 
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          ddH2O
          
			          		
			
			
          To 50 μL
          
			          		
		
          
	          

          


          注意：*Hieff NGSTM Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇。
          


          3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
          


          4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表4所示反應程序，進行PCR擴增。
          


          表4  PCR擴增反應程序
          


          
	
		
          
			
			
          溫度
          
			          		
			
			
          時間
          
			          		
			
			
          循環(huán)數(shù)
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          熱蓋105°C
          
			          		
			
			
          On
          
			          		
			 
		
          
		
          
			
			
          72°C
          
			          		
			
			
          3 min*
          
			          		
			
			
          1
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          95°C
          
			          		
			
			
          30 sec
          
			          		
			
			
          1
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          95°C
          
			          		
			
			
          spacer.gif10 sec
          
			          		
			
			
          n cycles**
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          55°C
          
			          		
			
			
          30 sec
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          72°C
          
			          		
			
			
          30 sec
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          72°C
          
			          		
			
			
          5 min
          
			          		
			
			
          1
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          4°C
          
			          		
			
			
          Hold
          
			          		
			 
		
          
	          

          


          注意：*此步不可省略。轉(zhuǎn)座反應產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。
          


          **循環(huán)數(shù)請根據(jù)測序需要進行選擇。起始DNA量為1 ng時，推薦8-15個擴增循環(huán)。
          


          3.3 文庫純化或分選（Library Clean UP/Size Selection）
          


          如對文庫長度分布無特殊要求，可直接使用1.0×磁珠純化擴增產(chǎn)物，而不進行片段分選。如需進行片段分選，則進行以下步驟，推薦使用Cat#12601 DNA Selection Beads進行產(chǎn)物片段分選，為防止接頭或大片段殘留，可進行兩次片段分選，或先使用1.0×磁珠純化擴增產(chǎn)物后再進行分選。
          


          1. 將平衡至室溫的Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠，振蕩或上下顛倒混勻。
          


          2. 根據(jù)DNA片段長度要求，進行雙輪分選時，需將初始DNA樣本用滅菌蒸餾水補齊至100 μL，參考表5推薦比例向文庫上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。【注意：因PCR過程中樣品揮發(fā)會導致產(chǎn)物體積不足50 μL，進行下面操作之前必須使用滅菌蒸餾水將體積補齊至100 μL，否則分選長度會與預期不一致?！?/span>
          


          表5  磁珠文庫分選推薦比例
          


          
	
		
          
			
			
          文庫平均總長度
          
			          		
			
			
          ~300 bp
          
			          		
			
			
          ~400 bp
          
			          		
			
			
          ~500 bp
          
			          		
			
			
          ~800 bp
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          第一輪磁珠用量
          
			          		
			
			
          80 μL (0.8×)
          
			          		
			
			
          70 μL (0.7×)
          
			          		
			
			
          60 μL (0.6×)
          
			          		
			
			
          50 μL (0.5×)
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          第二輪磁珠用量
          
			          		
			
			
          20 μL (0.2×)
          
			          		
			
			
          20 μL (0.2×)
          
			          		
			
			
          20 μL (0.2×)
          
			          		
			
			
          15 μL (0.15×)
          
			          		
		
          
	          

          


          注意：“×”數(shù)均根據(jù)PCR產(chǎn)物體積補齊至100 μL計算而得，如“0.6×”表示0.6×100 μL = 60 μL。
          


          3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。
          


          4. 參考表5向上清中加入第二輪分選磁珠。
          


          7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。
          


          8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
          


          9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。
          


          10. 重復步驟9，總計漂洗兩次。
          


          11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。
          


          12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。
          


          13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。此外，如需獲得長度分布更集中的文庫擴增產(chǎn)物，可使用膠回收方式進行長度分選和純化；如對文庫長度分布范圍等無特殊要求，擴增產(chǎn)物也可不進行長度分選，直接使用磁珠或柱純化試劑盒進行純化。
          


          3.4 文庫質(zhì)量控制
          


          通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項六。
          


          3.5 參考實例
          


          使用Hieff NGSTM Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®對1 ng嗜鹽桿菌gDNA樣本建庫，并分別使用1.0×磁珠進行純化，0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例進行長度分選，結(jié)果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。
          


           圖片3.png
          


          圖3  Agilent 2100 Bioanalyzer文庫質(zhì)量分析
          


           
          


          HB210811
          


           
          


           
          

             
           
           
           
           
           
           
           
          400-6111-883