Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Plant)利用RNase H消化法去除植物來源總RNA中的核糖體RNA（包括細(xì)胞質(zhì)18S、25S rRNA，線粒體18S、26S rRNA，葉綠體16S、23S rRNA）以保留信使RNA (mRNA)和其它非編碼RNA。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA均具有良好的rRNA去除效果。經(jīng)rRNA去除所獲得的RNA樣本可用于高通量測序分析mRNA和非編碼RNA，可顯著提高測序結(jié)果中有效數(shù)據(jù)比例，也可用于cDNA合成或其它下游應(yīng)用。

 

適用范圍

適用于多種植物來源的100 ng~1 μg 總RNA樣品；適用于完整或部分降解RNA樣品。

 

產(chǎn)品組分

 

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸，-20 °C存放。效期一年。

 

注意事項(xiàng)

1. 請使用無RNase污染的耗材，并對實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM 高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

2. RNA樣品應(yīng)不含基因組DNA污染，若樣品中有gDNA殘留，應(yīng)先進(jìn)行DNase I消化并純化后再用于本試劑盒。

3. RNA樣品最大投入體積為10 μL，若樣品體積較大，可先進(jìn)行濃縮。

4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

自備材料

1. RNA純化磁珠：Hieff NGS^® Cleaner (Cat#12602)或其他等效產(chǎn)品。

2. qRT-PCR質(zhì)檢rRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效產(chǎn)品。

3. 其他材料： 無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

 

操作步驟

1. 探針雜交

1.1 將探針和雜交Buffer從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

1.2 準(zhǔn)備RNA樣品：根據(jù)投入量和樣品濃度，計(jì)算RNA取樣體積，用Nuclease free H₂O稀釋至11 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反應(yīng)體系。

表1 探針雜交反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Hybridization Buffer	3
Probe Mix (Plant)	3
Total RNA	9（100 ng~1 μg）
Total	15

1.4 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

1.5 將上述 PCR 管置于PCR儀中，按照表2所示反應(yīng)程序，進(jìn)行探針雜交反應(yīng)。

表2 探針雜交反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋105°C	On
95 °C	2 min
95 °C-22 °C	0.1 °C/s
22 °C	5 min
4 °C	Hold

2. RNase H消化

2.1將RNase H消化試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表3所示，配制RNase H消化反應(yīng)體系。

表3 RNase H消化反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
RNase H Buffer	3
RNase H	2
上步產(chǎn)物	15
Total	20

2.2 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

2.3 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：熱蓋50°C，37 °C，30 min； 4°C，hold，進(jìn)行RNase H消化反應(yīng)。

3. DNase I 消化

3.1將DNase I消化試劑從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表4所示，配制DNase I消化反應(yīng)體系。

表4 DNase I消化反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
DNase I Buffer	27.5
DNase I	2.5
上一步產(chǎn)物	20
Total	50

3.2 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3.3 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：熱蓋50 °C，37 °C，30 min；4 °C，hold，進(jìn)行DNase I消化反應(yīng)。

4. RNA純化

4.1 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS^® RNA Cleaner (Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。用Nuclease free H₂O配制80%乙醇。

4.2 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

4.3 吸取110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步產(chǎn)物中，移液器充分吹打混勻，室溫孵育 5 min。

4.4 將PCR管置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始終置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重復(fù)步驟 4.5，總計(jì)漂洗兩次。用 10 μL移液器吸干凈殘留液體。

4.7 保持 PCR 管始終置于磁力架中，室溫下開蓋干燥磁珠 (5~10 min)。

4.8 RNA洗脫：將PCR 管從磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用適合下游實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)體積Nuclease free H₂O或洗脫緩沖液），使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。

4.9 將 PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取 10 μL 上清（可根據(jù)步驟4.7選擇的實(shí)際洗脫體積進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】：洗脫后的樣品請立即進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，或置于-80 °C存放。

 

案例展示

1）15種不同的植物樣本，投入1μg進(jìn)行RNA建庫測試，rRNA的殘留率如圖1所示，rRNA殘留率都在2%以內(nèi)。

圖1 不同類型植物樣本，rRNA的殘留率檢測。

2）不同客戶返樣的植物樣本，投入1μg進(jìn)行RNA建庫測試，rRNA的殘留率如圖2所示，rRNA殘留率都在2%以內(nèi)。

圖2 不同客戶返樣植物樣本，rRNA的殘留率檢測。

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