產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
血液樣本來源的mRNA中珠蛋白mRNA約占30%-70%，占據(jù)了大量的RNA測序數(shù)據(jù)，因此血液樣本RNA建庫過程中珠蛋白mRNA的去除是提高測序數(shù)據(jù)信息量的有效方法。Hieff NGS® One-Step Globin mRNA Removal Kit (Cat#12260)利用靶向技術(shù)在cDNA合成過程中高特異性地抑制總RNA中的珠蛋白mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，而不影響其他mRNA、非編碼RNA以及環(huán)狀RNA等非靶RNA的cDNA合成，從而在一鏈cDNA合成過程中高特異性去除珠蛋白mRNA。本產(chǎn)品結(jié)合翌圣生物的Hieff NGS® One-Step rRNA Removal Kit (Cat#12258/12259)，可以對人類血液樣本來源RNA中的rRNA和珠蛋白mRNA進行快速靶向去除。這種靶向去除技術(shù)相較于傳統(tǒng)的RNase H消化法具有耗時短 (4 min)、操作簡單（一步操作）和非靶RNA保留完整等優(yōu)點，極大簡化了操作流程和提高了建庫效率，可以與市面上各類一鏈cDNA合成試劑配套使用。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA均具有良好的珠蛋白mRNA去除效果。經(jīng)珠蛋白mRNA去除所獲得的cDNA樣本可用于高通量測序分析mRNA和非編碼RNA，可顯著提高測序結(jié)果中有效數(shù)據(jù)比例，也可用于其它cDNA下游應(yīng)用。提供的試劑已經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證，最大程度上保證了珠蛋白mRNA去除的穩(wěn)定性和重復性。
適用范圍
適用于全血RNA來源的1 ng-1 μg的總RNA樣品。
產(chǎn)品組分
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產(chǎn)品組份 |
12260ES08 |
12260ES24 |
12260ES96 |
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One-Step Globin mRNA Removal Mix |
8 μL |
24 μL |
96 μL |
運輸與保存方法
干冰運輸，-20°C存放。效期兩年。
注意事項
一、關(guān)于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進行清理，推薦使用Thermo Fisher公司的RNAZapTM 高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。
3. RNA樣品應(yīng)不含基因組DNA污染，若樣品中有g(shù)DNA殘留，應(yīng)先進行DNase I消化并純化后再用于本試劑盒。
4. 若樣品體積較大，可先進行濃縮。
5. 本產(chǎn)品僅用作科研用途！
二、自備材料
1. qRT-PCR質(zhì)檢珠蛋白mRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效產(chǎn)品。
2. 其他材料：無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、PCR儀等。
使用方法
一、操作流程
圖1.使用快速去除rRNA (Cat#12258)及Globin mRNA (Cat#12260)試劑盒、RNA建庫試劑盒進行RNA建庫流程
二、操作步驟方案
方案1 :在逆轉(zhuǎn)錄體系中去除rRNA和Globin mRNA。
使用翌圣生物的Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11119)進行本試劑盒rRNA去除效率測試。
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系按下表進行（20 μL體系）：
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RNA非片段化體系* |
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RNA片段化體系** |
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在PCR管中加入以下組份： |
在PCR管中加入以下組份： |
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Total RNA |
1 ng-1 μg |
Total RNA |
1 ng-1 μg |
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Random Primers N6 (50 μM) |
1 μL |
Random Primers N6 (50 μM) |
1 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258/12259) |
1 μL |
One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258/12259) |
1 μL |
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One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260) |
1 μL |
One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260) |
1 μL |
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5×Hifair® Ⅱ Buffer |
4 μL |
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RNase free H2O |
To 14 μL |
RNase free H2O |
To 18 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)： |
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)： |
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94°C（片段化溫度和時間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
7 min |
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75°C |
1 min |
75°C |
1 min |
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65°C |
1 min
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65°C |
1 min |
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50°C |
2 min |
50°C |
2 min |
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4°C |
Hold |
4°C |
Hold |
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在PCR管中加入以下組份： |
在PCR管中加入以下組份： |
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上述反應(yīng)體系 |
14 μL |
上述反應(yīng)體系 |
18 μL |
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5×Hifair® Ⅱ Buffer |
4 μL
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Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
2 μL |
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
2 μL |
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Total |
20 μL |
Total |
20 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)： |
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)： |
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25°C |
5 min |
25°C |
5 min |
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42°C |
30 min |
42°C |
15 min |
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85°C |
5 min |
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85°C |
5 min |
【注】：*：RNA非片段化體系主要是為了保證RNA的完整性，主要應(yīng)用于cDNA庫的制備、RT-qPCR，低濃度RNA建庫和三代測序建庫等領(lǐng)域。
**：RNA片段化體系主要是為了保證RNA在建庫過程中的有效片段化，主要應(yīng)用于RNA二代測序?？蛻艨筛鶕?jù)實驗需求自行選擇。
2. qPCR檢測rRNA及Globin mRNA去除效果。
圖2.qPCR驗證rRNA及Globin mRNA一步法去除試劑盒的去除效果。 DEPC H2O：未添加去除rRNA和Globin mRNA的探針進行qPCR；Cat#12258+12260：在反應(yīng)體系中同時使用本公司試劑盒Cat#12258+Cat#12260的探針去除rRNA和Globin mRNA后進行qPCR。
方案2：在RNA NGS文庫構(gòu)建中去除rRNA和Globin mRNA。
1. 使用翌圣生物的Hieff NGS® Dual-mode RNA Library Prep Kit (Cat#12252 for Illumina, Cat#13332 for MGI)進行本試劑盒rRNA和Globin mRNA去除效率測試：
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組分 |
體積 |
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Total RNA |
1 ng-1 μg |
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2×Frag/Prime Buffer |
8.5 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258) |
1 μL |
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One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260) |
1 μL |
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DEPC H2O |
to 17 μL |
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)：
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溫度 |
時間 |
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94°C（片段化溫度和時間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
5-7 min |
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75°C |
1 min |
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65°C |
1 min |
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50°C |
2 min |
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4°C |
Hold |
反應(yīng)結(jié)束后接下游一鏈合成體系。
圖3.二代測序驗證一步法快速去除rRNA和Globin mRNA試劑盒的去除效果。DEPC H2O：未使用去除rRNA和Globin mRNA的探針進行建庫測序；Cat#12258+12260：在反應(yīng)體系中同時使用本公司試劑盒Cat#12258+Cat#12260的探針去除rRNA和Globin mRNA后進行建庫測序
2. 使用New England Biolabs的NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (Cat#E7760)聯(lián)合本試劑盒進行rRNA去除方案：
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組份 |
體積 |
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Total RNA |
1 ng-1 μg |
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First Strand Synthesis Reaction Buffer (5×) |
4 μL |
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Random Primers |
1 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix (Cat#12258) |
1 μL |
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One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260) |
1 μL |
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DEPC H2O |
to 10 μL |
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)：
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溫度 |
時間 |
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94°C（片段化溫度和時間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
5-15 min |
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75°C |
1 min |
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65°C |
1 min |
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50°C |
2 min |
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4°C |
Hold |
反應(yīng)結(jié)束后接下游一鏈合成體系。
方案3：在mRNA NGS文庫構(gòu)建中去除Globin mRNA。
使用翌圣生物的Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit mRNA (Cat#12603)進行本試劑盒mRNA的富集。
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組份 |
體積 |
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mRNA captured from total RNA |
X* |
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2×Frag/Prime Buffer |
8.5 μL |
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One-Step Globin mRNA Removal Mix (Cat#12260) |
1 μL |
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DEPC H2O |
to 17 μL |
吹打懸浮oligo (dT)磁珠，按照下列反應(yīng)程序進行反應(yīng)：
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溫度 |
時間 |
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94°C（片段化溫度和時間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
5-7 min |
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75°C |
1 min |
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65°C |
1 min |
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50°C |
2 min |
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4°C |
Hold |
【注】：*從100 ng-4 μg總RNA中進行捕獲得到的mRNA
反應(yīng)結(jié)束后接下游一鏈合成體系。
HB210809
