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Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®是針對MGI®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的新一代酶切法建庫試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫法比較，本品采用高質量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過程，同時簡化了操作流程，將片段化模塊與末端修復模塊合二為一，極大的降低了建庫的時間和成本。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉化率，可應用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組等樣本，同時能兼容FFPE DNA樣本的建庫。經測序驗證，不同GC含量的樣本，均可獲得優(yōu)異的測序結果，文庫覆蓋度高，均一性好，偏好性低，使建庫變得更加簡單高效。
- 適用10 ng-1 μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本
- 高質量片段化酶，可隨機切割雙鏈DNA，酶切片段無偏好性
- 片段化、末端修復/加A一步完成
- 強擴增效率的高保真酶，顯著提高文庫質量及產量
- 適用于FFPE DNA樣本
- 嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質控
產品組分
|
組分編號與名稱 |
13321ES16 |
13321ES96 |
||
|
13321-A |
|
Smearase® Mix |
160 μL |
960μL |
|
13321-B |
|
Ligation Enhancer |
480 μL |
4×720μL |
|
13321-C |
|
Fast T4 DNA Ligase |
80 μL |
480μL |
|
13321-D |
|
2×Ultima HF Amplification Mix |
400 μL |
4×600μL |
|
13321-E |
|
Primer Mix for MGI® |
80 μL |
480μL |
運輸與保存方法
冰袋運輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。
注意事項
一、關于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。
4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。
6. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
二、關于DNA片段化
1. 本試劑盒兼容范圍為10 ng – 1 μg Input DNA。應盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質量Input DNA。
2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響后續(xù)實驗，建議將DNA稀釋在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中進行片段化。
3. 對于常規(guī)的高質量基因組DNA，酶切時間參考表5，本試劑盒片段化偏好低，耐受各種GC含量的模板。對于不同降解程度的FFPE樣本，酶切時間參考表6。以上為推薦時間，需客戶在自己的實驗體系中進行微調，以達到最佳效果。
4.為保證優(yōu)質精確的片段化效果，片段化反應配制過程請于冰上操作。
5. 針對FFPE DNA建庫，若樣本質量不佳，客戶對當前建庫產量不滿意，可選購我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)對FFPE DNA進行修復，具體使用方法可參考此產品說明書。該試劑可與片段化末修加A過程同時進行，無需額外的操作。
三、關于接頭連接（Adapter Ligation）
1. 目前華大智造有2種序號的接頭：1-128和501-596。關于其使用要求，請詳見華大智造“關于Adapter使用”有關說明或咨詢本公司。此外，華大智造申明：2種接頭由于設計工藝不同，禁止混用，否則測序數據無法拆分！
2. Adapter的質量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產量。請按照表1和實際DNA投入量確實確定接頭用量，需要稀釋接頭時，請用TE buffer對接頭進行稀釋。
表1 10ng-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度
|
Input DNA |
10μM Adapter稀釋倍數 |
稀釋后投入量（μL） |
|
31ng-1 μg |
不稀釋 |
5 |
|
10-30 ng |
5 |
5 |
四、關于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。
2. 當Input DNA質量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。
3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪分選產生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟；如在末端修復/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。
4. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
6. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。
8. 進行長度分選時，初始樣品體積應盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導致移液誤差增大。
9. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
10. DNA純化或長度分選產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1個月。
五、關于文庫擴增（Library Amplification）
文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數。循環(huán)數不足，將導致文庫產量低；循環(huán)數過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環(huán)數。
表2 10 ng-1 μg Input DNA獲得1 μg產物擴增循環(huán)數推薦表
|
Input DNA（ng） |
Number of cycles required to generate |
|
1 μg |
|
|
1 μg |
3 - 5 |
|
500 ng |
4 - 6 |
|
200 ng |
5 - 7 |
|
50 ng |
8 - 10 |
|
10 ng |
10 - 12 |
【注】：建庫過程中若進行片段分選，擴增時請參照較高循環(huán)數擴增。
六、關于文庫質檢（Library Quality Analysis）
1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。
2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。
3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。
4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物以及其他不完整雙鏈結構產物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫干擾。
5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。
使用方法
一、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產品。
2. DNA質控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產品。
3. DNA Adapter：詳情請咨詢華大智造或本公司。
4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程
圖1 OnePot II DNA建庫試劑盒操作流程
三、操作步驟
3.1DNA片段化/末端修復/dA尾添加（DNAFragment/End Preparation/dA-Tailing）
該步驟將基因組DNA片段化，同時進行末端修復及dA尾添加。
1. 將表3中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于冰上配制表3反應體系。
表3 DNA片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應體系
|
名稱 |
體積（μL） |
|
Input DNA |
x |
|
Smearase® Mix |
10 |
|
ddH2O |
Up to 60 μL |
3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表4所示反應程序，進行DNA片段化，末端修復及dA尾添加反應。
表4 DNA片段化/末端修復/dA尾添加PCR反應程序
|
溫度 |
時間 |
|
熱蓋105°C |
On |
|
4 °C |
1 min* |
|
30 °C |
3-20 min** |
|
72 °C |
20 min |
|
4 °C |
Hold |
【注】：*DNA片段化過程為有效控制片段化效果，避免過度酶切，反應程序可預先設置4°C，待模塊溫度降至4°C時，將PCR管放入PCR儀即可。**對于完整的基因組DNA，酶切時間參考表5；對于質量不一的FFPE DNA樣本，酶切時間參考表6。
圖2 Agilent 2200定義不同降解程度樣本的DIN值
3.2 接頭連接（Adapter Ligation）
該步驟將3.1步驟的產物末端，連接特定的MGI®接頭。
1. 根據Input DNA量按表1稀釋Adapter至合適濃度。
2. 將表7中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
3. 于3.1步驟PCR管中配制表7所示反應體系。
|
名稱 |
體積（μL） |
|
dA-tailed DNA（3.1步驟產物） |
60 |
|
Ligation Enhancer |
30* |
|
Fast T4 DNA Ligase |
5 |
|
DNA Adapter |
5 |
表7 Adapter Ligation PCR體系
【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時離心后使用。
4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表8所示反應程序，進行接頭連接反應。
表8 Adapter Ligation PCR反應程序
|
溫度 |
時間 |
|
熱蓋105°C |
Off |
|
20°C |
15 min |
|
4°C |
Hold |
【注】：當Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。
3.3 連接產物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）
該步驟使用磁珠對3.2步驟的產物進行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產物。
3.3.1 純化操作步驟：
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取80μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation產物中，室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過5 min）。
8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：
1）如產物無需進行片段分選，直接加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min?！咀ⅲ喝缂兓a物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠
2）如產物需進行雙輪分選，加入102 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min?！咀ⅲ喝缂兓a物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。
3.3.2 雙輪分選操作步驟：
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。
2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。
3. 根據DNA片段長度要求，參考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。
表9 磁珠文庫分選推薦比例
|
DNA文庫插入片段大小 |
150 - 250 bp |
200-300 bp |
300-400 bp |
|
DNA文庫大小 |
230 - 330 bp |
280-380bp |
380-480bp |
|
第一輪體積比（Beads:DNA） |
0.78× |
0.68× |
0.58× |
|
第二輪體積比（Beads:DNA） |
0.20× |
0.20× |
0.20× |
【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為200 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用戶在接頭連接前進行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）說明書中推薦的比例。
4. 室溫孵育5 min。
5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉移上清到干凈的離心管中。
6. 參考表7向上清中加入第二輪分選磁珠。
7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。
8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。
10. 重復步驟9。
11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現龜裂（約5 min）。
12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。
13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移20 μL上清至干凈的管中。
3.4 文庫擴增（Library Amplification）
該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產物進行PCR擴增富集。
1. 將表10中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
2.于無菌PCR管中配制表10所示反應體系。
表10 PCR擴增反應體系
|
名稱 |
體積（μL） |
|
2×Ultima HF Amplification Mix |
25 |
|
Primer Mix for MGI |
5 |
|
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產物） |
20 |
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表11所示反應程序，進行PCR擴增。
表11 PCR擴增反應程序
|
溫度 |
時間 |
循環(huán)數 |
|
98°C |
1 min |
1 |
|
98°C |
10 sec |
參照注意事項中表1 |
|
60°C |
30 sec |
|
|
72°C |
30 sec |
|
|
72°C |
5 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
3.5 擴增產物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）
同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫擴增產物。
如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟。
3.6文庫質量控制
通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項六。
3.7 文庫環(huán)化
使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®（Cat#13341）或其他等效產品進行文庫單鏈環(huán)化反應。
3.8 參考實例
使用Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®對小牛胸腺gDNA樣本進行酶切建庫檢測，片段化結果見圖3；建庫結果見圖4。
圖3 OnePot II DNA建庫試劑盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA樣本（不同酶切時間片段化效果檢測）
圖4 使用本試劑盒進行human gDNA樣本建庫，文庫進行電泳檢測
（Input DNA為50 ng，酶切12 min，擴增8 cycles）
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建庫試劑盒 |
產品編號 |
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24/96 T |
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24/96T |
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12204ES24/96 |
24/96 T |
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24/96 T |
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文庫構建磁珠 |
產品編號 |
規(guī)格 |
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5/60 mL |
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12600ES08/56 |
5/60 mL |
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Hieff NGS® DNA Selection Beads（Superior AMPure XP alternative） |
12601ES08/56 |
5/60 mL |
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12603ES24/96 |
24/96 T |
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建庫接頭 |
產品編號 |
規(guī)格 |
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13360ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
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13361ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
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13362ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
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13363ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
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16×4/×16/×100 T |
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13365ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
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建庫模塊 |
產品編號 |
規(guī)格 |
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16/96 T |
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12607ES24/96 |
24/96 T |
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2×Super Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix for Library Amplification |
12621ES24/96 |
24/96 T |
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Hieff NGS® Dual-Mode cDNA Synthesis Kit |
12250ES24/96 |
24/96 T |
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文庫定量 |
產品編號 |
規(guī)格 |
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Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix |
12302ES05 |
500 T |
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Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard (1-6) |
12307ES09 |
6×96 μL |
|
12640ES60/76 |
100/500 T |
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多重PCR定制咨詢 |
||
HB200415
