產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。采用的抗體法熱啟動DNA聚合酶（Cat#10113），在預變性溫度（95℃）加熱30 sec，UNICON® Taq抗體失活，釋放出Taq DNA Polymerase活性?？贵w法熱啟動Taq酶可以有效抑制引物非特異性退火導致的擴增。同時，配方優(yōu)化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，適合低濃度模板的擴增，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標準曲線。
Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗體、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
產(chǎn)品信息
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貨號 |
11198ES03 / 11198ES08 / 11198ES25 / 11198ES50 / 11198ES60 |
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規(guī)格 |
1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL |
儲存條件
-25~-15℃避光保存，有效期18個月。本品避免反復凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
使用說明
- 反應體系（推薦冰上配制）
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組分 |
體積 (μL)**** |
體積 (μL) |
終濃度 |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，No Rox)* |
25 |
10 |
1× |
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Forward Primer (10 μM)** |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM)** |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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模板DNA*** |
X |
X |
- |
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RNase Free H2O |
to 50 |
to 20 |
- |
*使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
**通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進行調(diào)整。
***如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好。
****推薦使用20 μL或50 μL總體積，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
2.擴增程序*
1）兩步法
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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預變性** |
95℃ |
30 sec |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火/延伸*** |
60℃ |
30 sec**** |
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熔解曲線階段***** |
儀器默認設置 |
1 |
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2）三步法
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
|
預變性** |
95℃ |
30 sec |
1 |
|
變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火*** |
55-60℃ |
20 sec |
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延伸 |
72℃ |
20 sec**** |
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熔解曲線階段***** |
儀器默認設置 |
1 |
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*高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。
**預變性時間可根據(jù)不同模板和引物的具體情況適當增加至3-5 min。
***退火溫度和時間請根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整。
****熒光信號采集請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：
30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec以上：Applied Biosystems: 7300
34sec以上：Applied Biosystems: 7500
*****熔解曲線通常情況下可以使用儀器默認程序。
- 結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1）擴增曲線
- Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；
- Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
- Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
- Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2）熔解曲線
a. 熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
b. 熔解曲線出現(xiàn)雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
c. 如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
d. 如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設計更高特異性的引物。
- 引物設計指南
1） 推薦引物長度25 bp左右。擴增產(chǎn)物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。
2） 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
3) 引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4) 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補序列。
5) 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6) 設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
5. 適用機型
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.
注意事項
1. 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
2. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（Cat#11141），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
3. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20240108
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