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        1. IF>5000經(jīng)典預(yù)混液Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)

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          產(chǎn)品說明書

          FAQ

          COA

          已發(fā)表文獻(xiàn)

          產(chǎn)品描述

          Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)2×實(shí)時定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混合溶液。Mix中含有熱啟動Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+使用時,僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR,大大簡化操作過程,降低污染幾率。

          本品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化實(shí)時調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特異性PCR擴(kuò)增的因子和提升PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的因子,使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。

           

          適用機(jī)型

          Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

          Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

          Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

          Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

          Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

           

          運(yùn)輸保存方式

          冰袋運(yùn)輸。-20避光儲存,有效期18個月。

          本品避免反復(fù)凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I,保存或配制反應(yīng)體系時需避免強(qiáng)光照射。

           

          注意事項(xiàng)

          1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒(貨號11123ES),以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。

          2. 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀物質(zhì),4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清,不影響試劑性能。

          3. 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

          4. 本產(chǎn)品僅作科研用途!

           

          反應(yīng)體系(推薦冰上配制)

          組分

          體積(μL

          體積(μL

          終濃度

          Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

          25

          10

          Forward Primer (10 μM)

          1

          0.4

          0.2 μM

          Reverse Primer (10 μM)

          1

          0.4

          0.2 μM

          模板DNA

          X

          X

          -

          無菌超純水

          to 50

          to 20

          -

          使用前務(wù)必充分混勻,避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。

          a) 引物濃度:通常引物終濃度為0.2 μM,也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。

          b) 模板濃度:如模板類型為未稀釋cDNA原液,使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10。

          c) 模板稀釋cDNA原液建議5-10倍稀釋,最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好。

          d) 反應(yīng)體系:推薦使用20 μL50 μL,以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

          e) 體系配制:請于超凈工作臺內(nèi)配制,并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管;推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
           

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          : 高特異性可選擇兩步法,高效率擴(kuò)增可選擇三步法。

          a) 預(yù)變性時間:根據(jù)不同模板和引物的具體情況可適當(dāng)縮短至2 min。

          b) 退火溫度和時間:請根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整。

          c) 熒光信號采集(:請按照儀器使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置,幾種常見儀器的時間設(shè)定如下:

          30sec以上:Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast;Roche Applied Science: LightCycler 480;Bio-Rad: CFX96

          31sec以上:Applied Biosystems: 7300

          34sec以上:Applied Biosystems: 7500

          d) 熔解曲線:通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。

           

          結(jié)果分析

          定量實(shí)驗(yàn)至少需要三個生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴(kuò)增曲線及熔解曲線。

          1) 擴(kuò)增曲線:標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線為S型。

          Ct值落在20-30之間時,定量分析最準(zhǔn)確;

          Ct值小于10時,需要將稀釋模板后,重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn);

          Ct值介于30-35之間時,需要提高模板濃度,或者增大反應(yīng)體系的體積,以提高擴(kuò)增效率,保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性;

          Ct值大于35時,檢測結(jié)果無法定量分析基因的表達(dá)量,但可用于定性分析。

          2) 熔解曲線:

          熔解曲線單峰,表明反應(yīng)特異性好可以進(jìn)行定量結(jié)果分析;若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰,則不能進(jìn)行定量分析。

          熔解曲線出現(xiàn)雙峰,需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標(biāo)峰是引物二聚體還是非特異性擴(kuò)增。

          如果是引物二聚體,建議降低引物濃度,或者重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增效率高的引物。

          如果是非特異性擴(kuò)增,請?zhí)岣咄嘶饻囟?,或者重新設(shè)計(jì)更高特異性的引物。

           

          引物設(shè)計(jì)指南

          1. 推薦引物長度25 bp左右。擴(kuò)增產(chǎn)物長度150 bp為佳,可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。

          2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2。引物Tm值60-65為佳。

          3. 引物堿基分布要均勻,避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

          4. 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補(bǔ)序列。

          5. 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進(jìn)行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補(bǔ)。

          6. 設(shè)計(jì)完成的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測,只有具備相同擴(kuò)增效率的引物才可用于定量比較分析。

           

          相關(guān)產(chǎn)品

          產(chǎn)品名稱

          貨號

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          HB210720

          400-6111-883