Hifair? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
批量采購， 請(qǐng)點(diǎn)擊詢價(jià)
產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有g(shù)DNA去除步驟的cDNA第一鏈合成試劑盒。該試劑盒基于Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)50℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可擴(kuò)增長達(dá)10 kb的cDNA。
該試劑盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，保證后續(xù)結(jié)果更加可靠。該試劑盒提供兩種cDNA合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)18，用戶可根據(jù)需要，選擇Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成的單鏈cDNA產(chǎn)物可直接用來進(jìn)行后續(xù)PCR或者qPCR反應(yīng)。
產(chǎn)品組分
|
組分編號(hào) |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格 11121ES60 (100 T) |
|
11121-A |
RNase-free H2O |
2×1 mL |
|
11121-B |
5×gDNA digester Buffer |
200 μL |
|
11121-C |
gDNA digester |
100 μL |
|
11121-D |
5×Hifair® Ⅱ Buffer plus |
400 μL |
|
11121-E |
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
200 μL |
|
11121-F |
Oligo (dT)18 (50 μM) |
100 μL |
|
11121-G |
Random Primers N6 (50 μM) |
100 μL |
【注】：
1）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制劑和dNTP。
2）Hifair® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。
運(yùn)輸和保存方法
干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期18個(gè)月。
注意事項(xiàng)
1）反應(yīng)液的配制應(yīng)在冰上操作完成，操作過程應(yīng)避免RNase污染。
2）建議RNA是溶于水而不是TE中，因?yàn)門E會(huì)干擾gDNA去除以及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3）可以不經(jīng)過基因組去除步驟，直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，這樣所得到的結(jié)果與使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat#11119）效果一致。但是請(qǐng)勿將gDNA digester與11119ES中的5×Hifair® Ⅱ Buffer配套使用，因其不含終止gDNA去除反應(yīng)的成分，會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)。
4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
5）本產(chǎn)品僅作科研用途！
關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇
1） 如果模板為真核生物來源，建議選擇Oligo (dT)18 ，與真核生物mRNA的3’ Poly A尾配對(duì)，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。
2）原核生物RNA的反轉(zhuǎn)錄請(qǐng)選用Random Primers N6或者基因特異性引物。
3）Random Primers N6適用性較廣，適用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
4）使用Random primers N6，進(jìn)行2 kb以下的cDNA合成時(shí)，Random primers N6的使用量為 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成時(shí)，Random primers N6 的使用量為0.4-1 μL。
第一鏈cDNA合成操作步驟
一、若實(shí)驗(yàn)需要去除殘留基因組DNA
1. 在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。
|
組分 |
使用量 |
|
RNase-free H2O |
To 10 μL |
|
5× gDNA digester Buffer |
2 μL |
|
gDNA digester |
1 μL |
|
Total RNA |
1 ng -5 μg* |
|
or mRNA |
1 ng-500 ng* |
【注】：* 若后續(xù)實(shí)驗(yàn)為qPCR，Total RNA投入量為1 ng -1 μg；mRNA的投入量為1 ng-100 ng。若基因的表達(dá)豐度很低，最多可投入5 μg Total RNA或500 ng mRNA。
2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）
|
組分 |
使用量 |
|
RNase-free H2O |
To 20 μL |
|
上一步的反應(yīng)液 |
10 μL |
|
5× Hifair® Ⅱ Buffer plus |
2 μL* |
|
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
2 μL |
|
Random Primers N6 (50 μM) |
1 μL |
|
or Oligo (dT)18 (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM) |
or 1 μL |
|
or 1 μL |
【注】：
1）逆轉(zhuǎn)錄引物：熒光定量實(shí)驗(yàn)推薦Random Primers N6與Oligo (dT)18 1:1混合使用。
2）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因gDNA digester buffer的影響，本體系中只需要加2 μL。
3）建議先加入5×Hifair® Ⅱ Buffer plus混勻后再添加反轉(zhuǎn)錄引物，以保證完全抑制gDNA digester的活性。
3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置
|
溫度 |
時(shí)間 |
|
25℃ |
5 min |
|
42℃ |
30 min |
|
85℃ |
5 min |
【注】：逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用42℃。對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到50℃。
4. 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
二、若實(shí)驗(yàn)無需去除基因組DNA
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）
|
組分 |
使用量 |
|
RNase-free H2O |
To 20 μL |
|
Total RNA |
1 ng -5 μg |
|
or mRNA |
1 ng-500 ng |
|
5× Hifair® Ⅱ Buffer plus |
4 μL* |
|
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers N6 (50 μM) |
1 μL |
|
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
2 μL |
【注】：
1）逆轉(zhuǎn)錄引物：熒光定量實(shí)驗(yàn)推薦Random Primers N6與Oligo (dT)18 1:1混合使用。
2）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因無gDNA digester buffer的影響，本體系中需要添加4 μL。
【可選步驟】：針對(duì)復(fù)雜模板，建議RNA、H2O、反轉(zhuǎn)錄引物在65℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻。然后再加入反轉(zhuǎn)錄酶和Buffer。
2. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置參照上述基因組去除后的逆轉(zhuǎn)錄程序。
HB220607
