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        1. Hifair? Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

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          產(chǎn)品說明書

          FAQ

          COA

          已發(fā)表文獻

          Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)基于Hifair®  Reverse Transcriptase而開發(fā)的即用型預混液。與Hifair®  Reverse Transcriptase相比,Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase熱穩(wěn)定性大幅度提高,可耐受高達60℃的反應溫度,適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。同時,該酶增強了與模板的親和力,非常適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉錄。

          該預混液包含5×gDNA digester MixHifair® Ⅲ SuperMix plus。5×gDNA digester Mix可去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染,保證后續(xù)結果更加可靠。Hifair® Ⅲ SuperMix plus 含有逆轉錄反應所需的所有組分(Buffer,dNTPHifair® Ⅲ Reverse Transcriptase,RNase inhibitor,Random primers/ Oligo (dT)18 primer mix),只需加入RNA模板和 RNase-free H2O即可進行逆轉錄反應,并同時終止gDNA digester的作用,保證cDNA的完整性。

          該產(chǎn)品適用于兩步法RT-qPCR檢測,針對qPCR進行特別優(yōu)化,比例優(yōu)化的Random primers/ Oligo (dT)18 primer mix,使cDNA合成可從RNA轉錄本的各個區(qū)域起始,并具有相同的逆轉錄效率,最大程度保證了qPCR結果的真實性和可重復性。逆轉錄產(chǎn)物兼容SYBR® Green和探針法qPCR,可以根據(jù)實驗目的,選擇Hieff UNICON® qPCR SYBR® Green Master Mix,Hieff® qPCR SYBR® Green Master MixHieff® qPCR TaqMan Probe Master Mix等試劑配合使用,進行高性能的基因表達分析。

           

          產(chǎn)品組分

          組分編號

          組分名稱

          產(chǎn)品編號/規(guī)格

          11141ES10 (10 T)

          11141ES60 (100 T)

          11141-A

          RNase-free H2O

          1 mL

          2×1 mL

          11141-B

          5×gDNA digester Mix

          30 μL

          320 μL

          11141-C

          4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus

          50 μL

          500 μL

          】:4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus含有gDNA digester抑制劑。

           

          產(chǎn)品應用

          適用于兩步法RT-qPCR。

           

          運輸和保存方法

          冰袋運輸。-20℃保存。有效期18個月。

           

          注意事項

          15×gDNA digester Mix4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus含有高濃度的甘油,使用前請短暫離心收集到反應管底部,并用移液槍輕輕吸打充分混勻后,準確吸??;

          2)如果加入RNA模板體積較大 (如超過2 μL),請確保RNA是溶于水中而不是TE中,因為TE會對gDNA去除以及逆轉錄反應產(chǎn)生抑制;

          3)可以不經(jīng)過基因組去除步驟,直接用4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus進行逆轉錄,這樣所得到的結果會與使用Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix  (Cat No.11137ES) 效果一致。但是請勿將gDNA digester11137ES中的Hifair® Ⅲ SuperMix配套使用,因其不含終止gDNA digester反應的成分,會影響反轉錄和后續(xù)的qPCR實驗;

          4)反應液的配制應在冰上操作完成,操作過程應避免RNase污染;

          5)為了您的安全和健康,請穿實驗服并佩戴一次性手套操作;

          6)本產(chǎn)品僅作科研用途!

           

          第一鏈cDNA合成操作步驟

          1. 殘留基因組DNA去除

          RNase free離心管中配制如下混合液,用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。

          組分

          使用量

          RNase-free H2O

          To 15 μL

          5×gDNA digester Mix

          3 μL

          Total RNA

          or mRNA

          10 pg -5 μg* 

          10 pg-500 ng*

          】:* 20 μL逆轉錄反應體系建議Total RNA的投入量不超過1 μg。如果目的基因的表達豐度低,最多投入5 μg Total RNA,否則RNA投入量過高,可能會超過后續(xù)定量PCR的線性范圍。

          2. 逆轉錄反應體系配制(20 μL體系)

          在第1步的反應管中直接加入4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus,用移液器輕輕吹打混勻。

          組分

          使用量

          1步的反應液

          15 μL

          4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus

          5 μL

          3.逆轉錄標準程序設置

          溫度

          時間

          25℃

          5 min

          55℃

          15 min

          85℃

          5 min

          】:逆轉錄溫度:推薦使用55℃。對于GC含量模板或者復雜模板,可將逆轉錄溫度提高到60℃。

             逆轉錄快速程序設置

          溫度

          時間

          55℃

          15 min

          85℃

          5 sec

          】:逆轉錄快速程序適用于中低GC含量(≤55%)或者簡單模板。

          逆轉錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應,也可-20℃短期保存,若需長期保存,建議分裝后,于-80℃保存,避免反復凍融。

          HB221101

          400-6111-883