高質(zhì)量cDNA合成的不二之選--Hifair? III系列逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品
研發(fā)背景
RT-PCR是常用到的實驗手段，cDNA的質(zhì)量關(guān)乎qPCR、PCR等實驗的成敗?？此坪唵蔚膶嶒?，但總是不可避免的碰到一些實驗問題：
1）RNA濃度低，逆轉(zhuǎn)錄效果差，Ct值不理想；
2）RNA具有二級結(jié)構(gòu)或GC含量高導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄失敗；
3）逆轉(zhuǎn)錄酶的合成長度達不到要求；
4）逆轉(zhuǎn)錄時間太長，嚴重影響實驗進度；
5）cDNA質(zhì)量差，基因擴增失敗...
基于以上易出現(xiàn)的實驗問題，Yeasen在Hifair® II Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上開發(fā)了Hifair® III Reverse Transcriptase，其cDNA合成速度快，熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達65℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，非常適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。
Hifair® III系列逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品選擇指南
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全長cDNA合成 |
全長cDNA合成 |
Real Time RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液 |
Real Time RT-PCR反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液 （基因組去除） |
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產(chǎn)品名稱 |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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產(chǎn)品貨號 |
11111 |
11139 |
11137 |
11141 |
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產(chǎn)品形式 |
單酶 |
試劑盒 |
即用型預(yù)混液 |
即用型預(yù)混液 |
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引物形式 |
自備 |
自選 |
Oligo dT和Random primer混合物 |
Oligo dT和Random primer混合物 |
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基因組去除 |
－ |
+ |
－ |
+ |
產(chǎn)品特點
1、cDNA合成速度快，大大縮減逆轉(zhuǎn)錄時間；
2、熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達65℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄;
3、增強了與模板的親和力，非常適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄;
產(chǎn)品性能
1、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度達55℃，耐受65℃高溫
圖1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度達55℃，耐受65℃高溫。反應(yīng)溫度55℃可滿足常規(guī)模板及二級結(jié)構(gòu)模板的轉(zhuǎn)錄，高GC模板可適當提高到65℃反應(yīng)。
2、延伸性能優(yōu)越，可合成長達19.8 kb的cDNA
圖2. 最長可合成19.8kb的cDNA。 RNA 投入量為500ng， A、B、C分別為經(jīng)過 Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（11139） gDNA消化、gDNA消化跳過、T品牌Kit逆轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板擴增DYNC1H1（19.8kb）的結(jié)果。逆轉(zhuǎn)程序為各產(chǎn)品的標準逆轉(zhuǎn)錄程序。綜上，Hifair® III Reverse Transcriptase可合成長達19.8kb的cDNA。
3、cDNA合成速度較快，5min內(nèi)可合成6kb的cDNA
圖3. cDNA合成速度較快，5min內(nèi)可合成6kb的cDNA。以293T細胞的 RNA為模板，按說明書標準程序進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄時間按5、10、15、30、45、60min分別進行設(shè)置。Hifair® III Reverse Transcriptase 5min內(nèi)可合成6kb的cDNA，特異性和產(chǎn)量均優(yōu)于V品牌。
4、適用性廣泛，適合不同GC含量、不同表達豐度的基因
圖4. 適合不同GC含量、不同表達豐度的基因。針對不同GC含量、不同表達豐度的基因，Hifair® III Reverse Transcriptase相對市面同類產(chǎn)品ct值更低，具有更高的逆轉(zhuǎn)錄效率。
5、寬廣的模板線性范圍內(nèi)均可高效合成cDNA
GAPDH：E=98.47%，R2=0.998
RPS2：E=98.79%，R2=0.998
AGTPBP1：E=100.08%，R2=0.998
GLUD1：E=100.35%，R2=0.998
圖5. Hifair® III Reverse Transcriptase在很寬的模板范圍內(nèi)均可高效合成cDNA。 Total RNA投入量為5pg-5μg，逆轉(zhuǎn)錄按說明書標準程序進行，所得cDNA對4個基因進行qPCR檢測，結(jié)果顯示擴增效率均在98-100.10%之間。說明在寬廣的模板線性范圍內(nèi)均可高效合成cDNA。
6、高效去除基因組殘留，讓實驗結(jié)果更準確
Positive control：25ng Mus gDNA作為模板進行qPCR檢測。
實驗1：25ng Mus gDNA，按說明書標準程序進行g(shù)DNA去除后逆轉(zhuǎn)錄（gDNA digester具備gDNA消化功能），所得產(chǎn)物進行qPCR檢測。
實驗2：25ng Mus gDNA，同時加入gDNA digester Mix和Hifair® III SuperMix處理（注意：該步驟可導(dǎo)致gDNA digester消化gDNA功能失效），按說明書程序逆轉(zhuǎn)錄后進行qPCR檢測。
圖6. 帶有gDNA去除組分的產(chǎn)品可高效去除gDNA殘留。 試劑盒中的gDNA digester組分可高效去除殘留基因組，當加入10×Hifair® III Super buffer后，消化功能終止，可實現(xiàn)去除RNA模板中g(shù)DNA的干擾，保證定量結(jié)果準確。
7、RNA最大可投入12μL，有利于低濃度模板檢測
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1）殘留基因組DNA去除 |
2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) |
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組分 |
使用量 |
組分 |
使用量 |
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RNase free ddH2O |
To 15 μL |
第1步的反應(yīng)液 |
15 μL |
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5×gDNA digester Mix |
3 μL |
4×Hifair® III SuperMix plus |
5 μL |
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模板RNA |
Max:12 μL |
產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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11111ES92 |
10000U |
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11111ES93 |
50000U |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
100T |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES10 |
100T |
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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銷量高，明星定量產(chǎn)品 |
11201ES08 |
5mL |
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黑科技，彩色版通用型定量產(chǎn)品 |
11184ES08 |
5ml |
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