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Hifair^? III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

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產(chǎn)品說明書

FAQ

COA

已發(fā)表文獻(xiàn)

Hifair^®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有g(shù)DNA去除步驟的cDNA第一鏈合成試劑盒。該試劑盒基于Hifair^®III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。Hifair^®III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達(dá)19.8 kb的cDNA。

該試劑盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，保證后續(xù)結(jié)果更加可靠。該試劑盒提供兩種cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)₁₈，用戶可根據(jù)需要，選擇Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成的單鏈cDNA產(chǎn)物可直接用來進(jìn)行后續(xù)PCR或者qPCR反應(yīng)。

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	11139ES10 / 11139ES60
規(guī)格	10 T / 100 T

組分信息

組分編號(hào)	組分名稱	11139ES10	11139ES60
11139-A	RNase-free H₂O	1 mL	2×1 mL
11139-B	5×gDNA Digester Mix	30 μL	300 μL
11139-C	10×Hifair^® III Super Buffer*	20 μL	200 μL
11139-D	Hifair^® III RT Enzyme Mix**	10 μL	100 μL
11139-E	Random Primers N6 (50 μM)	10 μL	100 μL
11139-F	Oligo (dT)₁₈ (50 μM)	10 μL	100 μL

*10×Hifair^® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制劑和dNTPs。

** Hifair^® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃避光儲(chǔ)存，有效期18個(gè)月。

使用說明

1.關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇

1）如果模板為真核生物來源，建議選擇Oligo (dT)₁₈ ，與真核生物mRNA的3’Poly A尾配對(duì)，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。

2）原核生物RNA的反轉(zhuǎn)錄請(qǐng)選用Random Primers N6或者基因特異性引物。

3）Random Primers N6適用性較廣，適用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2.第一鏈cDNA合成操作步驟

1）若實(shí)驗(yàn)需要去除殘留基因組DNA

a. gDNA消化

在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。

組分	使用量
RNase-free H₂O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg-5 μg*
or mRNA	10 pg-500 ng*

表1 gDNA消化體系*

*若后續(xù)實(shí)驗(yàn)為qPCR，Total RNA投入量為10 pg -1 μg；mRNA的投入量為10 pg-100 ng。若基因的表達(dá)豐度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	15 μL
10×Hifair^® III Super Buffer	2 μL
Hifair^® III RT Enzyme Mix	1 μL
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
RNase-free H₂O	to 20 μL

表2逆轉(zhuǎn)錄體系(以20 μL為例)*

*使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。

1）逆轉(zhuǎn)錄引物：后續(xù)進(jìn)行qPCR時(shí)，推薦Random Primers N6與Oligo (dT)₁₈ 1:1混合使用。

2）建議先加入10×Hifair^® III Super Buffer混勻后再添加逆轉(zhuǎn)錄引物，以保證完全抑制gDNA digester的活性。

3）體系配制完成后，請(qǐng)用移液器輕輕吹打混勻。

c. 逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表3逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)程序*

*標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)置建議。

1）逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用55℃。對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到60℃。

2）逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間：后續(xù)進(jìn)行qPCR時(shí)，推薦15 min；若后續(xù)用于PCR時(shí)，推薦30 min-60 min。

d. 逆轉(zhuǎn)錄快速程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
55℃	15 min
85℃	5 sec

表4逆轉(zhuǎn)錄快速程序*

*逆轉(zhuǎn)錄快速程序適用于中低GC含量（≤55%）或者常規(guī)模板后續(xù)的熒光定量實(shí)驗(yàn)。

e. 產(chǎn)物保存

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

2）若實(shí)驗(yàn)無需去除殘留基因組DNA

a. RNA模板變性

在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并靜置3 min。

組分	使用量
RNase-free H₂O	To 17 μL
Total RNA	10 pg -5 μg
or mRNA	10 pg-500 ng
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL

表5 RNA模板變性體系

b. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	17 μL
10×Hifair^® III Super Buffer	2 μL
Hifair^® III RT Enzyme Mix	1 μL

表6逆轉(zhuǎn)錄體系(以20 μL為例)*

c. 逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表7逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)程序*

*標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)置建議。

1）逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用55℃。對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到60℃。

2）逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間：后續(xù)進(jìn)行qPCR時(shí)，推薦15 min；若后續(xù)用于PCR時(shí)，推薦30 min-60 min。

d. 逆轉(zhuǎn)錄快速程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
55℃	15 min
85℃	5 sec

表8逆轉(zhuǎn)錄快速程序*

*逆轉(zhuǎn)錄快速程序適用于中低GC含量（≤55%）或者常規(guī)模板后續(xù)的熒光定量實(shí)驗(yàn)。

e. 產(chǎn)物保存

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

3）miRNA第一鏈cDNA莖環(huán)法合成操作步驟

a. gDNA消化

在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。

組分	使用量
RNase-free H₂O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg -5 μg

表9 gDNA消化體系

b. miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	15 μL
10×Hifair^® III Super Buffer	2 μL
Hifair^® III RT Enzyme Mix	1 μL
Gene Specific Primer (10 μM)	1 μL
RNase-free H₂O	to 20 μL

表10 miRNA逆轉(zhuǎn)錄體系(以20 μL為例)*

*1）建議先加入10×Hifair^® III Super Buffer混勻后再添加逆轉(zhuǎn)錄引物，以保證完全抑制gDNA digester的活性。

*2）體系配制完成后，請(qǐng)用移液器輕輕吹打混勻。

c. miRNA逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表11 miRNA標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序*

*a. 逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間：后續(xù)進(jìn)行qPCR時(shí)，推薦15 min；若后續(xù)用于PCR時(shí)，推薦30 min-60 min。

注意事項(xiàng)

反應(yīng)液的配制應(yīng)在冰上操作完成，操作過程應(yīng)避免RNase污染。
建議RNA是溶于水而不是TE中，因?yàn)門E會(huì)干擾gDNA去除以及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
5×gDNA digester Mix、10×Hifair^® III Super Buffer、Hifair^® III RT Enzyme Mix使用前請(qǐng)輕輕上下顛倒混勻，并小心離心至底部。吸取液體時(shí)請(qǐng)使用量程合適的移液器，槍頭不要插入液面下過深。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
qPCR實(shí)驗(yàn)推薦基因組去除步驟，保證結(jié)果更加真實(shí)可靠。
本產(chǎn)品僅作科研用途！

Ver.CN20230407

Q：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的引物如何選擇？

A：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可按下列建議選擇（選擇指南可見下表）：

a）對(duì)于全長第一鏈 cDNA 合成，且模板為真核生物來源，推薦選擇Oligo (dT)引物。b）當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或模板為原核生物來源，推薦選擇 Random Primers 引物。

c）基因特異性引物（GSP）是與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。d）若逆轉(zhuǎn)錄后續(xù)為 qPCR 實(shí)驗(yàn)，可將 Oligo (dT)與Random Primers 混合使用。

逆轉(zhuǎn)錄引物選擇指南
	特征	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)	結(jié)合方式
Oligo (dT)	1）12-20 個(gè) T； 2）與真核生物 mRNA 的3 ’ Poly A 尾配對(duì)。	可合成全長 cDNA。	1 ）僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA； 2 ）對(duì)模板質(zhì) 量要求高。
Random Primers	1）6-9 個(gè)堿基； 2）可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合。	適合復(fù) 雜結(jié) 構(gòu) 和微量模板。	特異性低，小片段多。
基因特異性引物（GSP）	識(shí)別特定模板序列。	特異性強(qiáng)，靈敏度高。	僅合成特定的序列。

Q：能否用來做 miRNA/circRNA/lncRNA 的逆轉(zhuǎn)錄？

A：有 A 尾的 lncRNA 用預(yù)混液和 KIT （ 11123/11141/11121/11139）都可以， circRNA、miRNA 和無 A 尾的 lncRNA 用 KIT（11121/11139）。microRNA 需要特殊的莖環(huán)引物，需特別針對(duì)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

Q：克隆逆轉(zhuǎn)和定量逆轉(zhuǎn)有什么區(qū)別？克隆逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物和定量逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物可以相互嗎？

A：a）目的不同：克隆逆轉(zhuǎn)后的 cDNA 后續(xù)用于基因克隆，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以普通 PCR 為主；定量逆轉(zhuǎn)后的 cDNA 后續(xù)用于基因定量，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以qPCR 為主。

逆轉(zhuǎn)錄過程不同：克隆逆轉(zhuǎn)使用 Oligo dT，保證合成的長度。隨機(jī)引物使用較少；定量逆轉(zhuǎn)使用 Oligo dT 或隨機(jī)引物，或兩者混合使用。
克隆逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物可用于 qPCR，但定量逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物不推薦用于普通 PCR，定量逆轉(zhuǎn)試劑中含 Oligo (dT)與 Random Primers 混合引物，產(chǎn)物長度較短，可做短片段 PCR，過長的不適合。

Q：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可以逆轉(zhuǎn)真菌（或其他物種）RNA 嗎？有沒有專門針對(duì)真菌（或其他物種）的RNA 逆轉(zhuǎn)錄的試劑盒呢？

A：RNA 的物種與逆轉(zhuǎn)錄沒有很大關(guān)系，RNA 質(zhì)量與逆轉(zhuǎn)錄有關(guān)。所以，得到 RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒都可以用，沒有特別針對(duì)的。

Q：RNase 殘留降解RNA？

A：原因：若去除試劑中殘留 RNase，會(huì)使 RNA 發(fā)生降解，減少了 RNA 模板量，導(dǎo)致效果差。

檢測(cè)方法：RNA 去除試劑前后分別進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)RNA 完整性。優(yōu)化方法：選用無RNase 級(jí)別的 gDNA 去除試劑。

Q: miRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄可以用這款產(chǎn)品嗎？

A: 可以的，設(shè)計(jì)特異性引物替代試劑盒中的引物加入到程序中。參考程序如下：

莖環(huán)引物（10uM) :1ul

上一步的反應(yīng)液：15ul

10×super buffer：2ul

RT enzyme mix: 1ul

ddH2O: 1ul

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400-6111-883

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