Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase是在Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過(guò)基因工程技術(shù)得到的新一代逆轉(zhuǎn)錄酶，與Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase相比，其cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，非常適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase合成全長(zhǎng)cDNA的能力也有了提升，可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)19.8 kb的cDNA。

 

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	11111ES92 / 11111ES93 / 11111ES08
規(guī)格	10,000 U / 50,000 U/ 5 mL
單位定義	以Poly(A) .Oligo(dT)為模板-引物，在37℃，10 min內(nèi)，將1 nmol的dTTP摻入為酸不溶性物質(zhì)所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。

 

組分信息

組分編號(hào)	組分名稱	11111ES92	11111ES93	11111ES08
11111-A	5×Hifair® Ⅲ Buffer	250 μL	1,250 μL	25 mL
11111-B	Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (200 U/μL)	50 μL	250 μL	5 mL

 

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃保存，有效期18個(gè)月。

 

使用說(shuō)明

第一鏈cDNA合成操作步驟

1. RNA變性（此步為可選步驟，RNA變性有助于打開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，可在很大程度上提高第一鏈cDNA的產(chǎn)量。）

組分	使用量
RNase free ddH2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM)	1 μL or 1 μL or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 10 pg - 5 μg或mRNA: 10 pg - 500 ng

65℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻2 min。簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液后，加入下表中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并輕輕吹打混勻。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	13 μL
5×Hifair® Ⅲ Buffer	4 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (200 U/μL)	1 μL
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL

3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
25℃*	5 min
55℃**	15-30 min***
85℃****	5 min

*當(dāng)使用Random Primers時(shí)，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略。

**逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用55℃。對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高至60℃。

***可將逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間延長(zhǎng)到45-60min，有助于提高產(chǎn)量。

****85℃加熱5 min，目的是使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)PCR或qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存，若需長(zhǎng)期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

 

注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗(yàn)所用耗材均需保證RNase free，以防止RNase污染。

2. 所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行，防止RNA降解。

3. 為保證高效率逆轉(zhuǎn)錄，建議使用高質(zhì)量的RNA樣本。

4. 本產(chǎn)品僅用作科研用途。

5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20230426