Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒
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產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
螢火蟲(chóng)螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)為560 nm左右的生物熒光，該螢光可通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)原理如圖所示：
圖1：螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)原理圖
Luciferase Reporter Gene Assay kit是一閃光型螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，具有靈敏度高的特點(diǎn)，可以高靈敏的檢測(cè)螢光素酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。
產(chǎn)品組分
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組分編號(hào) |
組分名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格 |
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11401ES60（100 T） |
11401ES76（500 T） |
11401ES80（1000 T） |
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11401-A |
細(xì)胞裂解液 |
20 mL |
5×20 mL |
10×20 mL |
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11401-B |
螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)試劑 |
10 mL |
5×10 mL |
10×10 mL |
運(yùn)輸和保存方式
干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。
試劑盒內(nèi)螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)試劑不能反復(fù)凍融，建議分裝-20℃或-80℃保存。
注意事項(xiàng)
1）檢測(cè)過(guò)程中需自備耗材和設(shè)備包括如下：PBS；100 μL移液器或者排槍?zhuān)徊煌腹獍咨笜?biāo)板；Luminometer發(fā)光計(jì)、多功能酶標(biāo)儀或者其他能夠檢測(cè)生物發(fā)光的儀器；
2）反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對(duì)溫度較為敏感，加樣檢測(cè)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用；
3）檢測(cè)儀器：能檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測(cè)得的光信號(hào)值也會(huì)不同；
4）檢測(cè)設(shè)置：Luminescence，350-700 nm，建議檢測(cè)時(shí)間設(shè)為2-10 sec；
5）檢測(cè)板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標(biāo)板。黑色酶標(biāo)板也可用，但因黑色會(huì)吸收光信號(hào)，可能會(huì)降低信號(hào)；
6）單管熒光測(cè)定儀測(cè)定，每個(gè)樣品與測(cè)定試劑混合后到測(cè)定前的時(shí)間應(yīng)保持一致；
7）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套；
8）本產(chǎn)品僅作科研用途！
實(shí)驗(yàn)步驟
I.前處理
1.細(xì)胞
1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。
2）轉(zhuǎn)染步驟請(qǐng)參照相關(guān)的說(shuō)明書(shū)。
3）將細(xì)胞裂解液充分混勻，按如下方式加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞。
a: 對(duì)于貼壁細(xì)胞，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細(xì)胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂解液完全覆蓋細(xì)胞；
b: 對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液。
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細(xì)胞培養(yǎng)板 |
96孔板 |
48孔板 |
24孔板 |
12孔板 |
6孔板 |
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裂解液加入量 |
100 μL |
150 μL |
200 μL |
300 μL |
500 μL |
冰上孵育5 min，充分裂解細(xì)胞。
【注】：裂解產(chǎn)物可室溫保存6 h；4℃保存16 h；-80℃可長(zhǎng)期存放（裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融），本試劑盒裂解液數(shù)量按照24孔板添加量進(jìn)行配制，如需要更多可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)（CAT#11406）。
5）（選作）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。
2.葉片組織（以煙草葉片為例，僅供參考）
1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。
2）挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基（添加相應(yīng)抗生素）中，28℃ 220 rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
3）農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至1.0。
4）將待檢測(cè)的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行混合，使每種菌液的OD600為0.5。
5）選取生長(zhǎng)期為1個(gè)月左右完全伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進(jìn)行注射。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，需要將對(duì)照載體和待檢測(cè)目標(biāo)載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長(zhǎng)背景。
6）正常溫室生長(zhǎng)條件下，24-48 h即可取樣觀(guān)察。
7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤(pán)，放入2 mL的 EP 管（提前放入3-4個(gè)小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進(jìn)行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。
8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。
9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。
3.原生質(zhì)體（僅供參考）
構(gòu)建相應(yīng)的載體。
制備原生質(zhì)體（參考相關(guān)文獻(xiàn)：Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572）。
在2 mL EP管中加入相應(yīng)的載體（加入量需要摸索），加入100 μL原生質(zhì)體懸浮液。輕搖混勻后，加入110 μL PEG-CaCl2溶液，輕彈混勻。在室溫放置10-15 min。
4）加入440 μL W5溶液，上下顛倒以停止轉(zhuǎn)化。
5）200× g 室溫離心5 min，棄去上清，加入800 μL WI溶液重懸原生質(zhì)體。
室溫避光培養(yǎng)16-24 h。
7）將原生質(zhì)體加入2 mL離心管中，離心收集原生質(zhì)體，加入100 μL左右的裂解液。
8）冰上孵育5 min左右，充分裂解原生質(zhì)體。
9）（選做）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。
II.熒光檢測(cè)
1）按照儀器說(shuō)明書(shū)要求將熒光測(cè)定儀打開(kāi)，設(shè)定參數(shù)，測(cè)定時(shí)間為10 sec，測(cè)定間隔為2 sec。
2）取20 μL裂解液加入測(cè)量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入100 μL螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)試劑，震板混勻
2-3次，充分混勻后測(cè)定RLU（Relative light unit）。
3）分析數(shù)據(jù)。
①實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模诿總€(gè)培養(yǎng)板中都應(yīng)設(shè)置對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。為了保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，理論上每個(gè)實(shí)驗(yàn)組（包括對(duì)照組）都應(yīng)當(dāng)減去空白對(duì)照組的螢火蟲(chóng)螢光素酶的發(fā)光測(cè)量值。
a.空白對(duì)照組：
背景F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)試劑。
注：空白對(duì)照組的樣品量必須與實(shí)驗(yàn)樣品量相同，包含與實(shí)驗(yàn)樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合，并加上完全相同的檢測(cè)試劑。
b.實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)化合物處理(即實(shí)驗(yàn)組F)。
c.對(duì)照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞不經(jīng)處理，用以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(即對(duì)照組F)。
②計(jì)算結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)組=實(shí)驗(yàn)組F-背景F。
對(duì)照組=對(duì)照組F-背景F。
表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組。
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱(chēng) |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit輝光型螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 |
11404ES60/80 |
100/1000 T |
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Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 |
11405ES60/80 |
100/1000 T |
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Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 |
11401ES60/76/80 |
100/500/1000 T |
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pGM-CMV Luciferase Reporter Plasmid Positive Control pGM-CMV-Luc熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照 |
11556ES03 |
1 μg |
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Luciferase Reporter Plasmid negative control （熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陰性對(duì)照） |
11555ES03 |
1 μg |
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pGMLR-TK Luciferase Reporter Plasmid（pGMLR-TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒） |
11557ES03 |
1 μg |
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pGMLR-CMV Luciferase Reporter Plasmid（pGMLR-CMV海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒） |
11558ES03 |
1 μg |
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Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑 |
40802ES03 |
1 mL |
HB220325
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