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        1. Hieff Trans? Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑

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          產(chǎn)品說(shuō)明書

          FAQ

          COA

          已發(fā)表文獻(xiàn)

          產(chǎn)品描述

          Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑是一種多用途的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,適用于DNA、RNA和寡核苷酸的轉(zhuǎn)染,對(duì)大多數(shù)真核細(xì)胞具有很高的轉(zhuǎn)染效率。其獨(dú)特的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中,血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,這樣可以減少去除血清對(duì)細(xì)胞的損傷。轉(zhuǎn)染后不需要除去核酸-Hieff Trans®復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基,也可在46小時(shí)后除去。

          Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑以無(wú)菌的液體形式提供。通常情況下對(duì)于 24 孔板轉(zhuǎn)染,每次用1.5 μL左右,則1 mL 約可做660 次轉(zhuǎn)染;對(duì)于6孔板,每次用6 μL左右,則1 mL約可做160 次轉(zhuǎn)染

           

          運(yùn)輸與保存方法

          冰袋(wet ice)運(yùn)輸。產(chǎn)品2-8ºC保存,一年有效。不可冷凍!

           

          注意事項(xiàng)

          1. Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑要求細(xì)胞鋪板密度較高,以60%-80%為佳,這有助于減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響,具體鋪板密度需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索;如果你研究的基因要求比較長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間,比如細(xì)胞周期相關(guān)基因,或者細(xì)胞表面蛋白,最好選擇細(xì)胞鋪板密度要求較低的轉(zhuǎn)染試劑,不適合用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。

          2. Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染,并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基。但是,制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要求用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑,因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。另外,要檢測(cè)所用的無(wú)血清培養(yǎng)基與脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑的相容性,已知CD293, SFMII, VP-SFM就不相容。

          3. 轉(zhuǎn)染的時(shí)候培養(yǎng)基中不能添加抗生素。

          4. 使用高純度的DNARNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵。

          5. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體應(yīng)該在2-8ºC保存,要注意避免多次反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間開蓋,因?yàn)榭赡軙?huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。

          6. 初次使用應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例,通常推薦是1:2-1:3,比如24孔板內(nèi)接種0.5-2×105個(gè)細(xì)胞,使用0.5 µg DNA1-1.5 µL 轉(zhuǎn)染試劑。通過(guò)調(diào)整DNA/Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑比例優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率,DNAμg: 試劑μL)比值在1:0.5-1:5。

          7. 本產(chǎn)品僅作科研用途!

           

          操作流程(以24孔板為例,其他培養(yǎng)板加樣體積請(qǐng)參考表一) 

          【注】:轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響,建議初次使用時(shí)設(shè)置梯度進(jìn)行優(yōu)化最佳使用量。

          貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天(20-24小時(shí)),胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),細(xì)胞鋪板(不含抗生素),使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為70-95%0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate)。

          懸浮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染當(dāng)天,配制DNA復(fù)合物之前,24孔板中細(xì)胞鋪板,每500 µL生長(zhǎng)培養(yǎng)基(不含抗生素)中加入4-8 × 105 cells。

          1. 按照以下體系配制DNA-Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物:

          1)對(duì)于每孔細(xì)胞,使用50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基(41405ES Hieff® Optimal-MEM 培養(yǎng)基)稀釋0.5 μg DNA。混勻。

          2)對(duì)于每孔細(xì)胞,使用50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基(41405ES Hieff® Optimal-MEM 培養(yǎng)基)稀釋0.6-2.5 μL Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。

          Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑稀釋后室溫孵育5 min(在30 min內(nèi)同稀釋的DNA 混合,保溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低活性)

          【注意】:即使脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑使用41405ES Hieff® Optimal-MEM 培養(yǎng)基稀釋,細(xì)胞也可以使用DMEM培養(yǎng)。如果DMEM作為脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑的稀釋液,必須在5 min內(nèi)同稀釋的DNA混合。

          2. 混合稀釋的DNA和稀釋的脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑(總體積100 µL),輕輕混勻,并在室溫(15-25)孵育20 min,使得DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成。此時(shí)溶液可能會(huì)混濁,但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。

          【注意】DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物室溫至少穩(wěn)定保存5 h

          3. 直接將100 µL DNA-Hieff Trans®復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板,輕輕混勻。

          【注意】:如果在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染,使用含血清的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長(zhǎng)培養(yǎng)基,替換為500 µL無(wú)血清培養(yǎng)基。

          4. 37,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48 h,直至進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析,無(wú)需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。然而,可能有必要在4-6 h后更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基,不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。

          穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株:轉(zhuǎn)染24 h后,按照1:10或更高比例在細(xì)胞中加入新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h后加入篩選培養(yǎng)基。

          懸浮細(xì)胞株:在細(xì)胞中加入DNA-Hieff Trans®復(fù)合物后,如果需要可以4 h后加入PMA/PHA。對(duì)于Jurkat細(xì)胞,PHAPMA的終濃度分別為1 µg/mL50 ng/mL,可以提高CMV啟動(dòng)子活性和基因表達(dá)。對(duì)于K562細(xì)胞,只加入PMA足以提高啟動(dòng)子活性。

           

          轉(zhuǎn)染體系的調(diào)整

          對(duì)于不同的細(xì)胞培養(yǎng)板,Hieff Trans®脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑、DNA、細(xì)胞和培養(yǎng)基的使用量會(huì)有所不同,具體請(qǐng)參考下表(表一)。對(duì)于96 孔板培養(yǎng),不需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板,可以直接在平板中制備復(fù)合物,然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了,這樣進(jìn)一步減少了轉(zhuǎn)染時(shí)間。這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過(guò)293-H,293-FCOS-7LCHO細(xì)胞的試驗(yàn),同傳統(tǒng)方法相比活性稍低??旖莸牟襟E和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的高效轉(zhuǎn)染使得脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑非常適用于96 孔板的高通量轉(zhuǎn)染,比如cDNA文庫(kù)的篩選和蛋白瞬時(shí)表達(dá)。

          表一 在不同的培養(yǎng)容器中轉(zhuǎn)染,脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑,核酸,細(xì)胞和培養(yǎng)基的用量

          Culture vessel

          Surf. area per well1

          Shared reagents

          DNA transfection

          RNAi transfection

          Vol. of plating medium

          Vol. of dilution medium2

          DNA

          脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑

          RNA

          脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑

          96-well

          0.3 cm2

          100 μL

          2×25 μL

          0.1 μg

          0.2-0.5 μL

          5 pmol

          0.25 μL

          24-well

          2 cm2

          500 μL

          2×50 μL

          0.5 μg

          0.6-2.5 μL

          20 pmol

          1.0 μL

          12-well

          4 cm2

          1 mL

          2×100 μL

          1 μg

          2-4.5 μL

          40 pmol

          2.0 μL

          6-well

          10 cm2

          2 mL

          2×250 μL

          2-4 μg

          5-10 μL

          100 pmol

          5 μL

          60-mm

          20 cm2

          5 mL

          2×0.5 mL

          4-8 μg

          10-20 μL

          200 pmol

          10 μL

          10-cm

          60 cm2

          15 mL

          2×1.5 mL

          12-24μg

          30-60 μL

          600 pmol

          30 μL

          1 不同廠商提供的細(xì)胞培養(yǎng)板表面積可能有所不同;

          2 稀釋DNARNAi所用的培養(yǎng)基體積。

          【注】:該表使用量?jī)H供參考,具體使用量還需根據(jù)細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。使用時(shí)DNAμg: Hieff Trans®μL)比值保持在1:0.5-1:5

           

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          40805ES02

          0.5 mL

          40805ES03

          1.0 mL

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          5×1 mL

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          40806ES02

          0.5 mL

          40806ES03

          1.0 mL

          Polyethylenimine Linear(PEI) MW25000 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑MW25000

          40815ES03

          1 g

          40815ES08

          5×1 g

          Polyethylenimine Linear(PEI) MW40000rapid lysis)線性PEI轉(zhuǎn)染試劑(速溶型)MW40000

          40816ES02

          100 mg

          40816ES03

          1 g

          HB220930

           

          400-6111-883