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        1. Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

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          產(chǎn)品說(shuō)明書

          FAQ

          COA

          已發(fā)表文獻(xiàn)

          產(chǎn)品描述

          螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)是一種分子量約為61 kDa的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,能夠催化螢光素(luciferin)氧化成oxyluciferin,在氧化的過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)為560 nm左右的生物螢光。海腎螢光素酶(Renilla luciferase)是一種分子量約為36 kDa的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化腔腸素(coelenterazine)氧化成coelenteramide,在氧化的過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)為480nm左右的生物螢光。兩種生物螢光都可通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)原理如圖所示:

          image.png 
          1:螢火蟲和海腎螢光素酶檢測(cè)原理圖


          通常將目的基因的5´UTR或啟動(dòng)子克隆至Firefly Luciferase的上游,或3´UTR克隆至Firefly Luciferase的下游,通過(guò)檢測(cè)螢火蟲螢光素酶的量來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子或調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Renilla Luciferase作為內(nèi)參,來(lái)消除細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率等的差異。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以螢光素為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因的活性,之后在淬滅該螢光反應(yīng)的同時(shí),以腔腸素為底物檢測(cè)海腎螢光素酶報(bào)告基因的活性。該試劑盒具有靈敏度的特點(diǎn)。

           

          產(chǎn)品組分

          組分編號(hào)

          組分名稱

          產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格

          11402ES60100 T

          11402ES801000 T

          11402-A

          細(xì)胞裂解液

          20 mL

          10×20 mL

          11402-B

          螢火蟲螢光素酶緩沖液

          10 mL

          10×10 mL

          11402-C

          螢火蟲螢光素酶底物(50 ×

          200 μL

          10×200 μL

          11402-D

          海腎螢光素酶緩沖液

          10 mL

          10×10 mL

          11402-E

          海腎螢光素酶底物(50 ×

          200 μL

          10×200 μL

           

          運(yùn)輸和保存方式

          干冰運(yùn)輸。 -20℃保存,有效期1。

          螢火蟲螢光素酶反應(yīng)工作液和海腎螢光素酶反應(yīng)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,且不能反復(fù)凍融,建議分裝-20℃-80℃分裝保存。

           

          實(shí)驗(yàn)步驟

          I.前處理

           

          1.細(xì)胞

          1構(gòu)建相應(yīng)的載體。

          2轉(zhuǎn)染步驟請(qǐng)參照相關(guān)的說(shuō)明書。

          3)將細(xì)胞裂解液充分混勻,按如下方式加入細(xì)胞裂解液,充分裂解細(xì)胞。

          a: 對(duì)于貼壁細(xì)胞,吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液,按照下表比例加入細(xì)胞裂解液,輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂解液完全覆蓋細(xì)胞;

          b: 對(duì)于懸浮細(xì)胞,離心棄去上清,按照下表比例加入裂解液

          細(xì)胞培養(yǎng)板

          96孔板

          48孔板

          24孔板

          12孔板

          6孔板

          裂解液加入量

          100 μL

          150 μL

          200 μL

          300 μL

          500 μL

          4)冰上孵育5 min,充分裂解細(xì)胞。
          裂解產(chǎn)物可室溫保存6 h4℃保存16 h;-80℃可長(zhǎng)期存放。(裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融)。

          5)(選作)10000-16000 rpm離心1 min,取上清。

           

          2.葉片組織(以煙草葉片為例,僅供參考)
          1)構(gòu)建相應(yīng)的載體。
          2挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落,接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基(添加相應(yīng)抗生素)中,28℃ 220 rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
          3農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD6001.0,1700× g離心5 min收集菌體后,用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗菌體2次;用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至1.0
          4將待檢測(cè)的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行混合,使每種菌液的OD6000.5。
          5選取生長(zhǎng)期為1個(gè)月左右完全伸展的煙草葉片,將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進(jìn)行注射。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性,需要將對(duì)照載體和待檢測(cè)目標(biāo)載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長(zhǎng)背景。
          6)正常溫室生長(zhǎng)條件下,24-48 h即可取樣觀察。
          73-4直徑為6-8 mm的葉盤,放入2 mLEP(提前放入3-4個(gè)小鋼珠)中,液氮中冷凍使用破碎儀進(jìn)行研磨破碎(45 Hz,30 s)。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。
          8)冰上孵育5 min左右,充分裂解葉片。
          910000-16000 rpm離心1 min,取上清。

           

          3.原生質(zhì)體(僅供參考)
          1)構(gòu)建相應(yīng)的載體。
          2)制備原生質(zhì)體參考文獻(xiàn)Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572)。

          3)WI溶液配置:0.5 M甘露醇和20mm KCl 溶于4 mm MES (pH 5.7),可在室溫下保存。
          W5溶液配置:154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 和5 mM KCl溶于2 mm MES (pH 5.7),可在室溫下保存。

          4)2 mL EP管中加入相應(yīng)的載體(加入量需要摸索),加入100 μL原生質(zhì)體懸浮液。輕搖混勻后,加入110 μL PEG-CaCl2溶液,輕彈混勻。在室溫放置10-15 min。
          5加入440 μL W5溶液,上下顛倒以停止轉(zhuǎn)化。
          6200 × g 室溫離心5 min,棄去上清,加入800 μL WI溶液重懸原生質(zhì)體。
          7)室溫避光培養(yǎng)16-24 h。

          8)將原生質(zhì)體加入2 mL離心管中,離心收集原生質(zhì)體,加入100 μL左右的裂解液。
          9)冰上孵育5 min左右,充分裂解原生質(zhì)體。
          10)(選做)10000-16000 rpm離心1 min,取上清。

           

          II.螢光檢測(cè)

          1)取20 μL裂解液,加至培養(yǎng)板中。按照實(shí)驗(yàn)需要,可設(shè)置3-5孔重復(fù)。

          2)配制螢火蟲螢光素酶反應(yīng)工作液和海腎螢光素酶反應(yīng)液,即螢火蟲螢光素酶底物(50 ×)和海腎螢光素酶底物(50 ×分別用對(duì)應(yīng)的緩沖液稀釋至1 ×工作液。并孵育至室溫。

          3)加入100 μL螢火蟲螢光素酶反應(yīng)液,震板混勻,檢測(cè)螢火蟲螢光素酶的活力,檢測(cè)盡量在30 min內(nèi)完成。

          4)加入100 μL海腎螢光素酶反應(yīng)液,震板混勻,檢測(cè)海腎螢光素酶的活力,檢測(cè)盡量在30 min內(nèi)完成。

          5)分析數(shù)據(jù)。

          實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模诿總€(gè)培養(yǎng)板中都應(yīng)設(shè)置對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。為了保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,理論上每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(包括對(duì)照組)都應(yīng)當(dāng)減去空白對(duì)照組的螢火蟲和海腎螢光素酶的發(fā)光測(cè)量值。
           

          a.空白對(duì)照 

          背景F:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑。

          背景R:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑+海腎螢光素酶檢測(cè)試劑。

          注:空白對(duì)照組的樣品量必須與實(shí)驗(yàn)樣品量相同,包含與實(shí)驗(yàn)樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合,并加上完全相同的檢測(cè)試劑。


          b.實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)化合物處理(即實(shí)驗(yàn)組F和實(shí)驗(yàn)組R)


          c.對(duì)照組:轉(zhuǎn)染細(xì)胞不經(jīng)處理,用以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(即對(duì)照組F和對(duì)照組R)。

          計(jì)算結(jié)果:

          實(shí)驗(yàn)組比值=(實(shí)驗(yàn)組F-背景F/(實(shí)驗(yàn)組R-背景R)。

          對(duì)照組比值=(對(duì)照組F-背景F/(對(duì)照組R-背景R)

          表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組比值/對(duì)照組比值。

          image.png

          2:細(xì)胞樣品螢火蟲和海腎螢光素酶檢測(cè)流程圖

           

          注意事項(xiàng)

          1)檢測(cè)過(guò)程中需自備耗材和設(shè)備包括如下:PBS、100 μL移液器或者排槍、不透光白色酶標(biāo)Luminometer發(fā)光計(jì)、多功能酶標(biāo)儀或者其他能夠檢測(cè)生物發(fā)光的儀器;

          2)反應(yīng)溫度:酶促反應(yīng)對(duì)溫度較為敏感,加樣檢測(cè)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫20-25℃再使用;

          3)檢測(cè)儀器:能檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的儀器都適用,但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同,測(cè)得的光信號(hào)值也會(huì)不同;

          4)檢測(cè)設(shè)置:Luminescence,350-700 nm,建議檢測(cè)時(shí)間設(shè)為2-10 sec

          5)檢測(cè)板:為防止孔間干擾,推薦使用不透光白色酶標(biāo)板。黑色酶標(biāo)板也可用,但因黑色會(huì)吸收光信號(hào),可能會(huì)降低信號(hào);

          6)單管螢光測(cè)定儀測(cè)定,每個(gè)樣品與測(cè)定試劑混合后到測(cè)定前的時(shí)間應(yīng)保持一致;

          7E組分海腎螢光素酶底物易揮發(fā),注意密封保存;

          8為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套。

          9本產(chǎn)品僅作科研用途!

           

          相關(guān)產(chǎn)品

          產(chǎn)品名稱

          貨號(hào)

          規(guī)格

          Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit輝光型螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

          11404ES60/80

          100/1000 T

          Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

          11405ES60/80

          100/1000 T

          Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

          11401ES60/76/80

          100/500/1000 T

          pGM-CMV Luciferase Reporter Plasmid Positive Control pGM-CMV-Luc螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照

          11556ES03

          1 μg

          Luciferase Reporter Plasmid negative control (螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陰性對(duì)照)

          11555ES03

          1 μg

          pGMLR-TK Luciferase Reporter PlasmidpGMLR-TK海腎螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒)

          11557ES03

          1 μg

          pGMLR-CMV Luciferase Reporter PlasmidpGMLR-CMV海腎螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒)

          11558ES03

          1 μg

          Hieff Trans Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑

          40802ES03

          1 mL

          HB230504

          400-6111-883