蛋白純化是將目標蛋白從實驗樣本總蛋白中分離出來，同時仍保留目的蛋白的生物學活性及化學完整性。

目的蛋白之所以能從混合物中分離出來也來源于蛋白獨特的性質，這些性質是由于蛋白質的氨基酸的序列和數目不同造成的，利用待分離的蛋白質與其他蛋白質之間在性質的差異，即能設計出一組合理的分級分離步驟?？梢罁鞍踪|不同性質與之相對應的方法將蛋白質混合物分離，

常用的方法有：凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、親和層析等。其中親和層析，是目前應用較多的純化方法。

表1. 不同層析方法對比

“*”表示等級之分，數量越多表示性能越好。

親和層析是應用生物高分子與配基可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固結合于載體上而制得的層析系統。這種可逆結合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結構的識別。在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱為配基。配基可以是酶的底物、抑制物、輔團因子、特異性的抗體等。

圖1. 親和層析純化原理

親和層析優(yōu)點

（1）適合于從成分復雜且雜質含量遠大于目標物的混合中提純目標物；

（2）分離條件溫和；

（3）結合效率高；

（4）分離速度快的優(yōu)點。

翌圣瓊脂糖凝親和層析常見的產品有樹脂填料以及預裝柱形式，使用方法可借助重力法、手動加壓法、蠕動泵法等。

圖2. 瓊脂糖凝膠親和層析產品示例圖

（1）樹脂前期準備

A、填料量計算：根據樹脂載量范圍以及蛋白的總量來確定填料的填充量；比如his純化樹脂（＞40 mg 6×His-tagged protein/mL基質），表示1ml基質結合融合蛋白總量大于40 mg，40 mg為樹脂的綜合載量，此時在接近樹脂結合載量時使用，可以獲得最好蛋白分離效果。所以要求我們前期估算蛋白的總量，以此來確定樹脂的使用量。

B、緩沖液：無菌水、 20% 乙醇、0.4 M NaCl 等溶液。

C、裝柱策略選擇
流動裝填：設置一個固定的流速或壓力，一步完成填料的沉降和壓縮；

逐步裝填：首先利用重力完成50%填料的沉降，然后將上層緩沖液移除，再次添加填料，逐步完成填料的填充，最終填料的體積需要多余柱體積的5%。

（2）重力柱使用流程

 圖3. 重力柱裝柱示意圖

第一：準備重力柱；

第二：將白色小墊片塞入重力空柱中，墊片可用20%乙醇濕潤；

第三：首先確認需要裝入填料體積，移液槍將填料和緩沖液一起加入重力柱中；

第四：利用平衡液平衡填料，平衡后開始純化樣本。

（3）C型空柱手動裝柱過程

圖4. C型空柱裝柱示意圖

第一：準備C型柱空管，注意下方堵頭不要去除；

第二：將白色小墊片塞入重力空柱中，墊片可用20%乙醇濕潤；

第三：樹脂與填料充分混勻，將混合液等體積裝入柱子中，等樹脂沉淀之后，用移液槍移除上層緩沖液；

第四：此時切勿將樹脂暴漏在空氣中太久，趕緊進行第五步；

第五：再次添加剩余柱體積的樹脂與緩沖液混合物，等樹脂沉淀后移除上層緩沖液。反復添加，保證最終樹脂的添加總量要超出柱體積的5%左右，以確保后期安裝完成的柱子中無空氣；

第六：先安裝上墊片，再把黑色分配器裝進去（分配器有接口的那邊朝上），蓋上紅色的蓋子；

第七；擰上上堵頭，裝柱完成，使用時將下堵頭去掉即可。

預裝柱的使用可借助多種方法實現蛋白樣本的純化，客戶可針對自己的實驗需求以及實驗室所具備實驗耗材選擇相應的方法：

圖5. 預裝柱使用方法示例圖

表2. 預裝柱不同純化方法的比較

Q1、目的蛋白大量表達時需要注意什么？

A：載體構建是否合適——檢查啟動子、讀碼框、終止子等。某些基因含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼子后15 個堿基內的，會顯著影響蛋白的表達;

表達系統是否恰當——常見的有四大表達系統，即大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞以及哺乳細胞表達系統。不同的表達系統適合表達不同的蛋白，這個要根據情況選擇;

標簽選擇是否合適——GST、SUMO 等標簽具有提高融合蛋白可溶性的能力。

Q2、C型柱樹脂填料裝柱時對稱性不好，如何解決？

Q3、不同的裝柱緩沖液會影響填料的哪些參數？

A：在不同的裝柱緩沖液中，填料的壓縮因子也會不同。通常填料在水和20％ 乙醇中均可快速沉降。添加一定的鹽會減慢填料沉降的速度，但同時也可以幫助填料不會壓得過于緊實。

Q4、填料是否可以重復使用？可以使用多少次?

A：如果維護的好的話，填料在其效期之內可以一直重復使用。舉例：his純化樹脂：如果每次都是純化同樣的蛋白就沒有必要剝離掉鎳離子重新掛鎳，一般經過5-7次純化之后可以進行脫鎳和再生鎳的操作。如果柱子反壓高了，填料需要做徹底的在位清洗CIP，在清洗之前，為了避免金屬鹽的沉淀，需要剝離掉鎳離子，然后再重新掛鎳，清洗后保存在20％的乙醇中。填料的壽命因使用的環(huán)境，純化的樣品的特性，保存方式等都有直接關系。

Q5、如何確定裝柱成功？

A：層析柱調水平；層析柱上下篩網無氣泡；膠懸液濃度控制在50%-60% ；了解填料裝柱因子和關鍵裝柱參數；

Q6、預裝柱常見問題有哪些？