蛋白純化是將目標(biāo)蛋白從實(shí)驗(yàn)樣本的總蛋白中分離出來(lái)，同時(shí)仍保留目的蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。在構(gòu)建載體階段，除了一些必要的表達(dá)元件，還需要考慮密碼子優(yōu)化以及標(biāo)簽的選擇。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化，促進(jìn)蛋白的可溶性，同時(shí)也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。以下簡(jiǎn)單列舉幾個(gè)常見(jiàn)蛋白標(biāo)簽：
表1. 不同蛋白純化標(biāo)簽介紹
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標(biāo)簽 |
大小 kDa |
序列 |
純度 |
增溶性 |
標(biāo)簽去除 |
標(biāo)簽切割酶 |
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His |
~0.84 |
HHHHHH |
+ |
+ |
不需要 |
TEV蛋白酶 |
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GST |
26 |
由211個(gè)氨基酸組成 |
++ |
++ |
需要 |
3C蛋白酶/PSP |
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MBP |
42 |
由大腸桿菌K12的malE基因編碼 |
++ |
++ |
需要 |
Factor Xa、EK |
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Strep(Ⅱ) |
1.06 |
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys |
++++ |
+ |
不需要 |
/ |
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Flag |
1.01 |
DYKDDDDK |
++++ |
+ |
不需要 |
EK |
His-Tag 為何會(huì)逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術(shù)之一。其主要優(yōu)勢(shì)在于：
序列兼容性高：N-端的His-tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；
序列小影響小：His-tag非常小，His-tag對(duì)目的蛋白本身特性幾乎沒(méi)有影響，不會(huì)改變目的蛋白本身的可溶性和生物學(xué)功能；且在融合蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)也沒(méi)有影響；
免疫原性低：His-tag的免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫并制備抗體；
聯(lián)合使用性強(qiáng)：與其他的親和標(biāo)簽構(gòu)建成聯(lián)合標(biāo)簽，可用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；
適用范圍廣：His標(biāo)簽融合蛋白的適用范圍也較廣，即可用在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進(jìn)行純化。前者通常用來(lái)純化疏水性強(qiáng)的目的蛋白，而后者通常純化包涵體蛋白。
因此，His逐漸成為了蛋白純化的首選標(biāo)簽。
HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni2+）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，與Ni-IDA樹(shù)脂相比，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件，與Ni-TED樹(shù)脂相比，目標(biāo)蛋白吸附量更大。已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室純化His標(biāo)簽蛋白不可或缺的樹(shù)脂之一。
圖1. His樹(shù)脂的產(chǎn)品原理圖
表2.不同配體所構(gòu)成樹(shù)脂的性能比較
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配體 |
Ni-NTA |
Ni-IDA |
Ni-TED |
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基質(zhì) |
瓊脂糖凝膠 |
有機(jī)硅樹(shù)脂 |
瓊脂糖凝膠 |
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Ni2＋與His tag結(jié)合位數(shù)目 |
2 |
3 |
1 |
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Ni2＋與螯合物結(jié)合位數(shù)目 |
4 |
3 |
5 |
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螯合物密度 |
最高 |
最低 |
介于前面兩者之間 |
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結(jié)合能力 |
≤50 mg/mL |
≤20 mg/mL |
≤10 mg/mL |
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產(chǎn)品特性 |
對(duì)于His-Tag 蛋白具有高度專(zhuān)一性結(jié)合 |
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蛋白結(jié)合能力最強(qiáng)， 載量最高 |
蛋白結(jié)合能力高于TED，低于NTA |
蛋白結(jié)合能力最低 |
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耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件 |
易受其他小分子的進(jìn)攻，破壞穩(wěn)定結(jié)構(gòu) |
耐受能力最強(qiáng)，可以在含有高濃度的EDTA及DTT等苛刻條件下進(jìn)行蛋白純化 |
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產(chǎn)品貨號(hào) |
20502ES |
20503ES |
20504ES/20505ES |
20561ES |
20497ES |
20498ES |
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英文名稱(chēng) |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5 mL / 1 mL |
HisSep Ni-NTA MagBeads |
Ni-TED Agarose Resin 6FF |
Ni-TED 6FF Chromatography Column, 5 mL |
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中文名稱(chēng) |
His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂 |
His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂 |
His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱 5 mL/1 mL |
His標(biāo)簽蛋白純化磁珠 |
His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂 |
His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱 5 mL |
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基質(zhì) |
交聯(lián)的6% 瓊脂糖凝膠 |
高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠 |
磁性瓊脂糖微球 |
高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠 |
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耐壓 |
0.1 MPa, 1 bar |
0.3 MPa, 3 bar |
0.3 MPa, 3 bar |
N/A |
0.3 MPa, 3 bar |
0.3 MPa, 3 bar |
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純化建議 |
基質(zhì)的耐壓一般，適合孵育法、重力柱小量純化 |
基質(zhì)的耐壓性高，搭配蛋白純化儀可以用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化 |
通過(guò)磁性分離快速便捷地進(jìn)行蛋白純化 |
基質(zhì)的耐壓性高，搭配蛋白純化儀可以用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化 |
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配體 |
Ni-NTA |
Ni-NTA |
Ni-TED |
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載量 |
＞40 mg 6×His-tagged protein/mL基質(zhì) |
> 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠 |
>15 mg His-tagged protein（27.5 KD）/mL基質(zhì) |
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耐受性 |
8 M urea、6 M 鹽酸、0.5-1 mM DTT、1 mM EDTA等 |
24 h耐受10 mM EDTA、5 mM DTT、1 M NaOH、6 M 鹽酸胍 ；2 h耐受500 mM咪唑，100 mM EDTA |
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應(yīng)用 |
His標(biāo)簽蛋白純化首選，載量高，耐受性一般，特別適用于原核表達(dá)純化體系 |
載量稍低，耐受性超強(qiáng)，特別適用于真核表達(dá)純化體系 |
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附：HisSep Ni-NTA MagBeads（Cat#20561ES）產(chǎn)品特點(diǎn)
1、與傳統(tǒng)預(yù)裝柱和樹(shù)脂相比，無(wú)需多次離心樣本和控制上樣流速，極大的縮短純化時(shí)間。
2、 一步純化即可得到高達(dá)95％以上純度的目標(biāo)蛋白
3、目標(biāo)蛋白產(chǎn)率高：產(chǎn)率可達(dá)到70～80％
4、可重復(fù)使用多達(dá)5次
5、可輕松調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白濃度和體積
6、蛋白損失小，且不存在蛋白變性、沉淀的風(fēng)險(xiǎn)
附：His-Tag Protein purification Kit(Agarose Resin)（Cat#20751ES）
His-Tag Protein purification Kit(Agarose Resin) (His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(瓊脂糖樹(shù)脂法)由HisSep Ni-NTA Agarose Resin（Cat#20502ES）、優(yōu)化預(yù)制的緩沖液（平衡、洗雜、洗脫緩沖液）、5 mL重力層析空柱（Cat#20522ES）組成，用于純化各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的可溶性His標(biāo)簽蛋白，為可溶性His標(biāo)簽蛋白的純化帶來(lái)了極大的便利。
測(cè)試產(chǎn)品：
1、某知名品牌His純化產(chǎn)品；
2、大量生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；
3、小樣生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；
4、本次生產(chǎn)的普通級(jí)別的His樹(shù)脂（20502ES）；
緩沖液：各個(gè)處理組均為1 mL樹(shù)脂純化200 mL菌液；洗雜使用25 mM的咪唑，洗脫液為250 mM的咪唑。
測(cè)試報(bào)告一：His純化樹(shù)脂結(jié)合效率測(cè)試，與市場(chǎng)知名品牌進(jìn)行對(duì)比，Yeasen研發(fā)的20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號(hào)）具有良好的結(jié)合效率。如下圖：
圖2. His純化樹(shù)脂結(jié)合效率測(cè)試
測(cè)試報(bào)告二：以常利用的變性劑尿素為例，分別進(jìn)行了不同產(chǎn)品在8M尿素下耐受性測(cè)試， 20502ESHisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號(hào)）對(duì)尿素的耐受良好，與市場(chǎng)知名品牌無(wú)差異。如下圖：
圖3. His樹(shù)脂對(duì)8M尿素耐受性測(cè)試
測(cè)試報(bào)告三：對(duì)于20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin（4號(hào)）進(jìn)行了批次檢測(cè)穩(wěn)定性測(cè)試，從結(jié)果看批次間差異基本控制在5%以?xún)?nèi)，以保證更好的穩(wěn)定性。如下圖：
圖4. His純化樹(shù)脂的批次間比較
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常見(jiàn)問(wèn)題 |
原因 |
優(yōu)化建議 |
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洗脫組分中無(wú)目的蛋白 |
蛋白可能是包涵體，沒(méi)在上清中 |
可以通過(guò)電泳檢測(cè)裂解液，分析上清中是否含有目的蛋白，包涵體蛋白需按照包涵體蛋白的純化方式 |
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表達(dá)量太低 |
優(yōu)化表達(dá)條件。 |
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目的蛋白結(jié)合比較弱，在洗雜步驟中已被洗下來(lái) |
提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑濃度 |
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目的蛋白結(jié)合過(guò)強(qiáng)，不容易洗脫下來(lái) |
降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑濃度。 |
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使用10-100 mM EDTA剝離鎳離子，同時(shí)得到目的蛋白 |
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洗脫組分不純（含多種蛋白）
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洗雜操作不徹底 |
增加Wash Buffer體積 |
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樣品中含有其他His標(biāo)簽蛋白 |
通過(guò)調(diào)節(jié)pH值或咪唑濃度來(lái)優(yōu)化洗雜條件。再使用其他純化手段（如去離子交換、疏水等）進(jìn)一步純化洗脫組分 |
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產(chǎn)品名稱(chēng) |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
目錄價(jià)/元 |
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HisSep Ni-NTA Agarose Resin His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂 |
10 mL /50 mL/ 100 mL/ 2x500 mL |
678/2848/5328/42686 |
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HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂 |
10 mL /50 mL/ 100 mL/ 1000 mL |
798/3358/5838/44686 |
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HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5 mL His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱, 5 mL |
5 mL/ 5x5 mL |
728/2938 |
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HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1 mL His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱, 1 mL |
1 mL/ 5x1 mL |
298/1048 |
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HisSep Ni-NTA MagBeads His標(biāo)簽蛋白純化磁珠 |
1 mL /5 mL/ 25 mL/100 mL |
275/825/1995/7095 |
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Ni-TED Agarose Resin 6FF His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂 |
10 mL /50 mL/ 100 mL/500 mL |
795/3355/5565/17665 |
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Ni-TED 6FF Chromatography Column, 5 mL His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱5 mL |
5 mL/ 5x5 mL |
728/2938 |
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His-Tag Protein purification Kit(Agarose Resin) His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(瓊脂糖樹(shù)脂法) |
10 mL |
1015 |
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產(chǎn)品名稱(chēng) |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
目錄價(jià)/元 |
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Anti-His Affinity Gel Anti-His標(biāo)簽親和純化凝膠 |
1 mL /5 mL/ 25 mL/100 mL |
4354/13756/ 62786/189756 |
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Imidazole咪唑 |
100 g/500 g |
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