產(chǎn)品簡介

 

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni²⁺）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經(jīng)成為實驗室純化His標(biāo)簽蛋白不可或缺的樹脂之一。

HisSep Ni-NTA Agarose Resin儲存在含20%乙醇的1×PBS 中，填料和保護(hù)液的比例為1:1，我司官網(wǎng)規(guī)格為實際填料的體積。

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 (瓊脂糖樹脂法)由HisSep Ni-NTA Agarose Resin、優(yōu)化預(yù)制的緩沖液、重力層析空柱組成，用于純化各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的可溶性His標(biāo)簽蛋白，為可溶性His標(biāo)簽蛋白的純化帶來了極大的便利。

 

產(chǎn)品信息

 

類別	編號	組分名稱	20751ES10	保存方式	翌圣貨號
Part Ⅰ	20751-A	HisSep Ni-NTA Agarose Resin His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹脂	10 mL	2~8℃	20502ES
	20751-B	Lysis Buffer（5×）	100 mL	2~8℃	N/A
	20751-C	Wash Buffer（5×）	100 mL	2~8℃	N/A
	20751-D	Elution Buffer	200 mL	2~8℃	N/A
Part Ⅱ	20751-E	重力層析空柱，5 mL（50 μm）	10×1套	RT	20522ES

 

儲存條件

 

2~8℃保存，有效期1年。

 

使用說明

 

1. 緩沖液配制

所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。

Lysis Buffer：Lysis Buffer（5×）（20751-B）, 使用時用蒸餾水或超純水稀釋成1×。

Wash Buffer：Wash Buffer（5×）（20751-C）, 使用時用蒸餾水或超純水稀釋成1×。

Elution Buffer：Elution Buffer（20751-D），可直接使用。

緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫。HisSep Ni-NTA Agarose Resin可以用于可溶性蛋白和包涵體蛋白的純化，此試劑盒搭配緩沖液只可用于可溶性His標(biāo)簽蛋白純化。

2. 樣品準(zhǔn)備

【注】樣品在上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，減少雜質(zhì)以防阻塞柱子。

1）細(xì)菌表達(dá)的蛋白（本說明以細(xì)菌表達(dá)蛋白為例）

a. 挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體說明加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時間。

b. 表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（Cat#20104ES）（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1 mM），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑（如蛋白酶抑制劑Cocktail（用于His-Tag蛋白純化）, Cat#20135ES03），但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合。

c. 之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1 mg/mL?！咀ⅰ咳绻磉_(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

d. 將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

e. 收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃離心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm濾膜過濾后，置于冰上備用或-20℃保存。

2) 酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)的可溶性蛋白

將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心瓶，5000 rpm離心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。 【注】對于大量體積的上清，需加入硫酸銨進(jìn)行沉淀濃縮，之后經(jīng)1×PBS 4℃下透析后上柱。

3.  HisSep Ni-NTA Agarose Resin重力柱的裝填

1）取重力層析柱，5 mL（20751-E），裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

 2）將HisSep Ni-NTA Agarose Resin（20751-A）混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入重力柱中（填料實際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護(hù)液。

3）加入適量純水沖洗填料，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）加入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之間沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入Lysis Buffer進(jìn)行平衡，暫不使用時則加入保護(hù)液，4℃保存。

     4. 重力柱法純化

1）將裝填好HisSep Ni-NTA Agarose Resin的重力柱用5倍柱體積Lysis Buffer進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù)2-3次。

2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min，保證樣品和填料充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3）用10-15倍柱體積的Wash Buffer進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

4）用5-10倍柱體積的Elution Buffer洗脫，分段收集，每一個柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

5）隨后依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗填料。5倍柱體積的20%乙醇平衡填料，最后將填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

     5. SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，判定其純化效果。

6. 填料清洗

當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)填料上面出現(xiàn)明顯的污染時，需對其進(jìn)行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1）去除強疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積，接觸時間為15-20 min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液，清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1 M醋酸溶液，接觸時間為1-2 h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，徹底去除去污劑。最后使用去離子水清洗10倍柱體積。

2) 去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接觸10-15 min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

7. 填料再生

His標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或填料載量明顯變低時，需要對其進(jìn)行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進(jìn)行：

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料；

2）使用5倍柱體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子；

3）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；

4）使用0.5 M NaOH清洗5倍柱體積，停留10-15 min；

5）使用去離子水清洗填料，直至pH中性；

6）使用3-5倍柱體積100 mM NiSO4再生掛鎳；

7）使用10倍柱體積去離子水清洗。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃?zhèn)溆谩?/font>

 

注意事項

 

1. 請勿冷凍保存本產(chǎn)品。
2. HisSep Ni-NTA Agarose Resin使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。
3. 所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

 

 

Ver.CN20250109