產(chǎn)品簡介   

GSTSep Glutathione Agarose Resin是一種GST標(biāo)簽蛋白純化樹脂，結(jié)構(gòu)上以6%交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過12個原子的間隔臂，用化學(xué)方法共價結(jié)合還原型谷胱甘肽制作而成。該設(shè)計使樹脂的純化效率得到了較大提高，使其每毫升基質(zhì)可承載>20 mg GST融合蛋白。

此外，本品特異性好，性價比高，可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽依賴性蛋白和谷胱甘肽重組衍生物。

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產(chǎn)品信息

貨號	20507ES10/20507ES50/20507ES60/20507ES80
規(guī)格	10 mL /50 mL /100 mL/1000 mL

 

產(chǎn)品性質(zhì)

基質(zhì)（Matrix）	6%交聯(lián)的瓊脂糖微球
配體（Ligand）	通過12原子間隔臂偶聯(lián)的谷胱甘肽
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	>20 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基質(zhì)
最大壓力（PressureMax）	0.1 MPa，1 bar
pH穩(wěn)定范圍（pH range）	3-12
儲存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS

 

儲存條件

2~8℃保存，有效期2年。

 

需準(zhǔn)備試劑

所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。

平衡/洗雜緩沖液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4

洗脫緩沖液：用平衡液配制10 mM 還原型谷胱甘肽（現(xiàn)配現(xiàn)用）

【注】平衡/洗雜緩沖液或洗脫緩沖液中可加入1-10 mM DTT。

 

使用說明

【注】樣品在上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，減少雜質(zhì)以防阻塞柱子。

1. 樣品準(zhǔn)備

1）細(xì)菌表達(dá)的蛋白（本說明以細(xì)菌表達(dá)蛋白為例）

a. 挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體說明加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時間。

b. 表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入1/10體積的平衡液和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1 mM），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合。

c. 之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1 mg/mL?！咀ⅰ咳绻磉_(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

d. 將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

e. 收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃離心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm濾膜過濾后，置于冰上備用或-20℃保存。

2) 酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)的可溶性蛋白

將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心瓶，5000 rpm離心10 min，收集上清。即可直接上柱純化；【注】對于大量體積的上清，需加入硫酸銨進(jìn)行沉淀濃縮，之后經(jīng)平衡液透析后才能上柱。

2. GSTSep Glutathione Agarose Resin重力柱的裝填

1. 取合適規(guī)格的重力層析柱（Cat#20520ES-20524ES），裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。
2. 將GSTSep Glutathione Agarose Resin混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入重力柱中（填料實(shí)際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護(hù)液。
3. 加入適量純水沖洗填料，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。
4. 加入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之間沒有空隙，且保持水平。
5. 裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時則加入保護(hù)液，4℃保存。

3. 樣品純化

1. 孵育法純化

1. 根據(jù)純化的樣品量，取適量GSTSep Glutathione Agarose Resin加入離心管中，1000 rpm離心1 min, 吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。

b. 向離心管中加入5倍填料體積的平衡液清洗填料，1000 rpm離心1 min，吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重復(fù)兩次以上。

c. 加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2~4 h或者37℃孵育30 min~2 h。

d. 孵育結(jié)束后，1000 rpm離心1 min，吸棄上清，或過濾收集填料，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

e. 用5倍填料體積的洗雜液清洗填料，1000 rpm離心1min 或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到填料），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。

f. 加入3-5倍柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，室溫孵育5 min，1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次。

2) 重力柱法純化

a. 將裝填好GSTSep Glutathione Agarose Resin的重力柱用5倍柱體積平衡液進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù)2-3次。

b. 將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min，保證樣品和填料充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

c. 用10-15倍柱體積的洗雜液進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

d. 用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫，分段收集，每一個柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

e. 隨后依次用3倍柱體積的平衡液和5倍柱體積的去離子水清洗填料。5倍柱體積的20%乙醇平衡填料，最后將填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4. SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，判定其純化效果。

5. 填料清洗

GST標(biāo)簽蛋白純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無需再生，但隨著非特異結(jié)合蛋白的增多和蛋白的聚集，會造成流速和結(jié)合載量性能下降，此時需對填料進(jìn)行清洗。

1）去除一些沉淀或變形物質(zhì)

用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。

2）去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)

用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。

 

注意事項(xiàng)

1. 請勿冷凍保存本產(chǎn)品。
2. GSTSep Glutathione Agarose Resin使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。
3. 所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。