產(chǎn)品簡介

 

GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一種GST標(biāo)簽蛋白純化樹脂，可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽依賴性蛋白和谷胱甘肽重組衍生物。在結(jié)構(gòu)上，該樹脂是以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過12個(gè)原子的間隔臂，用化學(xué)方法共價(jià)結(jié)合還原型谷胱甘肽制作而成，具有更高的物理化學(xué)特性，可以耐受更高的壓力，在相對較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對目的蛋白的純化，更適于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化。

GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 1 mL是裝填了GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的一種中壓預(yù)裝柱，規(guī)格1 mL，預(yù)裝柱具有標(biāo)準(zhǔn)接口，可以適配商品化的各類中壓色譜系統(tǒng)，如ÄKTA 等，方便客戶操作。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號(hào)	20509ES03/20509ES08
規(guī)格	1 mL /5×1 mL

 

產(chǎn)品性質(zhì)

 

基質(zhì)（Matrix）	高度交聯(lián)的4%瓊脂糖微球
配體（Ligand）	通過12原子間隔臂偶聯(lián)的谷胱甘肽
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	>10 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基質(zhì)
最大壓力（PressureMax）	0.3 MPa，3 bar
pH穩(wěn)定范圍（pH range）	3-12
儲(chǔ)存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS

 

儲(chǔ)存條件

 

2~8℃保存，有效期2年。

 

需準(zhǔn)備試劑

 

所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。

平衡/洗雜緩沖液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4

洗脫緩沖液：用平衡液配制10 mM 還原型谷胱甘肽（現(xiàn)配現(xiàn)用）

【注】平衡/洗雜緩沖液或洗脫緩沖液中可加入1-10 mM DTT。

 

使用說明

 

【注】樣品在上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，減少雜質(zhì)以防阻塞柱子。

1. 樣品純化（以Akta為例）

1）準(zhǔn)備：將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中。再折斷下口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗層析柱中儲(chǔ)存液。

3）平衡：用5倍柱體積的平衡Buffer平衡層析柱，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。

4）上樣：將樣品加到平衡好的層析柱中，推薦流速1 mL/min，保證目的蛋白與樹脂充分接觸，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待檢測。
   注意：樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會(huì)導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進(jìn)樣器更難使用。

5）洗雜：用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進(jìn)行清洗，直到紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液，待檢測。

6）洗脫：用洗脫Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常5倍柱體積洗脫液足夠?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?。也可以用一個(gè)小的梯度，例如20倍柱體積或更多，來分離不同結(jié)合強(qiáng)度的蛋白質(zhì)。

7）清洗與保存：依次使用3倍柱體積的平衡Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

2. SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，判定其純化效果。

3.   填料清洗

GST標(biāo)簽蛋白純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無需再生，但隨著非特異結(jié)合蛋白的增多和蛋白的聚集，會(huì)造成流速和結(jié)合載量性能下降，此時(shí)需對填料進(jìn)行清洗。

1）去除一些沉淀或變形物質(zhì)

用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。

2）去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)

用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。

 

注意事項(xiàng)

 

1.請勿冷凍保存本產(chǎn)品。

2.所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

3.本產(chǎn)品僅作科研用途。

4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

 

附表 問題及解決方案

 

問題	可能原因	推薦解決方案
柱子反壓過高	填料被堵塞	清洗樹脂
		裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，或離心去除
	樣品太黏稠	樣品中含高濃度的核酸，延長破碎時(shí)間直至粘度降低，或添加DNaseI （終濃度為5 µg/mL），Mg2+（終濃度1 mM），冰上孵育10-15 min
	緩沖液太黏稠	有機(jī)試劑或蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會(huì)引起反壓增高，降低操作流速
洗脫組分中無目的蛋白	GST標(biāo)簽蛋白變性了	使用溫和的裂解條件，實(shí)驗(yàn)條件以經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)
	過度的裂解使目的蛋白變性
	目的蛋白聚集產(chǎn)生沉淀	在細(xì)胞裂解前溶液中加入DTT，終濃度為1-10 mM
	融合蛋白改變了GST的構(gòu)象，影響了目的蛋白的結(jié)合力	測定pGEX中GST的結(jié)合力，對載體進(jìn)行超聲處理，檢測其結(jié)合力。如果載體中GST有很高的親和力，有可能是改變?nèi)诤系鞍椎臉?gòu)象從而降低了GST標(biāo)簽蛋白的親和力
		降低結(jié)合溫度至4℃，充分清洗
	柱子平衡時(shí)間太短，目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范圍內(nèi)結(jié)合	用pH 6.5-pH 8.0的buffer進(jìn)行充分的平衡，如PBS
目的蛋白沒有完全洗脫下來	洗脫體積太少	增加洗脫液體積，減小洗脫流速。
	洗脫液中谷胱甘肽濃度太低	增加洗脫液中還原型谷胱甘肽濃度，可嘗試用20-40 mM還原型谷胱甘肽洗脫。
	低pH影響洗脫	在不增加洗脫液中谷胱甘肽量時(shí)，提高洗脫液中pH至pH 8-9會(huì)有改善
		增加洗脫液中離子強(qiáng)度，如0.1-0.2 M NaCl
	洗脫液中谷胱甘肽被氧化	使用新鮮配制的洗脫液
		加入DTT
	非特異性疏水作用影響目的蛋白的溶解和洗脫	洗脫液中加入非離子型洗滌劑，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20
電泳或Western Blot檢測中發(fā)現(xiàn)多條帶	Mr 70000蛋白與目的蛋白一起純化下來	Mr 70000蛋白可能是大腸桿菌基因DnaK的產(chǎn)物，可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl，2 mM ATP，10 mM MgSO4，pH 7.4在37℃加熱10min去除
		可通過ATP-瓊脂糖膠或離子交換來去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白
	GST融合蛋白已經(jīng)發(fā)生降解	在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如加入1 mM PMSF
		可能是蛋白酶對目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT）
	細(xì)胞破碎過度	減少細(xì)胞破碎時(shí)間，超聲前加入溶菌酶（菌液體積的0.1倍10 mg/mL溶菌酶，25 mM Tris-HCl，pH 8.0），避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白酶變性，過度超聲破碎增加宿主內(nèi)源蛋白與GST融合目的蛋白的共純化。
	共價(jià)共純化	包括促進(jìn)蛋白正確折疊的分子伴侶的共純化，如：DnaK（Mr～70000），DnaJ（Mr～37000），GrpE（Mr～40000），GroEL（Mr～57000），GroES（Mr～10000）
	抗體與E. coli的各種蛋 白反應(yīng)	抗體吸附E. coli蛋白：GST-抗體；超聲處理去除GST抗體，可以用Western Blot檢測

Ver.CN20230921