產(chǎn)品簡介  

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni²⁺）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室純化His標(biāo)簽蛋白不可或缺的樹脂之一。

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產(chǎn)品信息

貨號(hào)	20502ES10 / 20502ES50 / 20502ES60 / 20502ES80
規(guī)格	10 mL / 50 mL / 100 mL / 2x500 mL

 

產(chǎn)品性質(zhì)

基質(zhì)（Matrix）	交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	＞40 mg 6×His-tagged protein/mL 基質(zhì)
耐壓（Tolerance Pressuremax）	0.1 MPa, 1 bar
儲(chǔ)存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS

 

儲(chǔ)存條件

2~8℃保存，有效期2年。

 

使用說明

1. 純化流程

1. 緩沖液的準(zhǔn)備

緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。HisSep Ni-NTA Agarose Resin可以用于可溶性蛋白和包涵體蛋白的純化，可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需配方詳見附表1。包涵體組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2。

2. 樣品準(zhǔn)備

1. 細(xì)菌表達(dá)的蛋白（本說明以細(xì)菌表達(dá)蛋白為例）

a）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體說明加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

b）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1 mM），同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑（如蛋白酶抑制劑Cocktail（用于His-Tag蛋白純化）, EDTA-free, 100×DMSO儲(chǔ)液，Cat#20135ES03），但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合。

c）之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1 mg/mL?！咀ⅰ咳绻磉_(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

d）將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

e）收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃離心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm濾膜過濾后，置于冰上備用或-20℃保存。

2. 酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)的可溶性蛋白

將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心瓶，5000 rpm離心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨進(jìn)行沉淀濃縮，之后經(jīng)1×PBS 4℃下透析后上柱。

3. 包涵體蛋白純化（以細(xì)菌為例，變性條件）

a）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心瓶，7000 rpm，離心15min，收集菌體去上清。

b）按照菌體：裂解液（不含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例將菌體充分懸浮，混勻，冰浴超聲破碎。

c）將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管，10000 rpm，4℃離心20-30min，去上清?？芍貜?fù)步驟b）和c）一次。

d）按照菌體：裂解液（含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例將包涵體充分懸浮。

e）變性條件下純化His標(biāo)簽蛋白。

3. HisSep Ni-NTA Agarose Resin重力柱的裝填

1. 取合適規(guī)格的重力層析柱（Cat#20520ES-20524ES），裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。
2. 將HisSep Ni-NTA Agarose Resin混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入重力柱中（填料實(shí)際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護(hù)液。
3. 加入適量純水沖洗填料，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。
4. 加入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之間沒有空隙，且保持水平。
5. 裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，4℃保存。

4. 樣品純化

1.   孵育法純化

1. 根據(jù)純化的樣品量，取適量HisSep Ni-NTA Agarose Resin加入離心管中，1000 rpm離心1 min, 吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。
2. 向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的Lysis Buffer清洗填料，1000 rpm離心1 min，吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis Buffer；重復(fù)兩次以上。
3. 加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2~4 h或者37℃孵育30 min~2 h。
4. 孵育結(jié)束后，1000 rpm離心1 min，吸棄上清，或過濾收集填料，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。
5. 用5倍填料體積的 Wash Buffer清洗填料，1000 rpm離心1min 或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到填料），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。
6. 加入3-5倍柱體積的Elution Buffer進(jìn)行洗脫，室溫孵育10-15 min，1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次。

2.   重力柱法純化

a）將裝填好HisSep Ni-NTA Agarose Resin 的重力柱用5倍柱體積Lysis Buffer進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù)2-3次。

b）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時(shí)間至少2 min，保證樣品和填料充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

c）用10-15倍柱體積的Wash Buffer進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

d）用5-10倍柱體積的Elution Buffer洗脫，分段收集，每一個(gè)柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

e）隨后依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗填料。5倍柱體積的20%乙醇平衡填料，最后將填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

5. SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，判定其純化效果。

2. 在位清洗                                                                                                當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高（＞0.5 MPa）或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需對(duì)其進(jìn)行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1. 去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

使用30%異丙醇清洗5-10個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為15-20 min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液，清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1 M醋酸溶液，接觸時(shí)間為1-2 h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，徹底去除去污劑。最后使用去離子水清洗10倍柱體積。

2) 去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接觸10-15 min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

3. 填料再生

His標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高（＞0.5 MPa），顏色變淺，或填料載量明顯變低時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進(jìn)行：

a）使用5倍柱體積去離子水清洗填料；

b）使用5倍柱體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子；

c）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；

d）使用0.5 M NaOH清洗5倍柱體積，停留10-15 min；

e）使用去離子水清洗填料，直至pH中性；

f）使用3-5倍柱體積100 mM NiSO₄再生掛鎳；

g）使用10倍柱體積去離子水清洗。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃?zhèn)溆谩?/font>

 

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

 

附表1 可溶性His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g  NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g
Elution Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

 

附表2 包涵體His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O   15.6 g Tris·HCl          15.76 g
Wash Buffer (pH6.3)	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至6.3, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O   15.6 g Tris·HCl          15.76 g
Elution Buffer (pH4.5)	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至4.5, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O   15.6 g Tris·HCl          15.76 g