產(chǎn)品說明書
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已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡介
Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因定量表達(dá)分析（如cell line 化的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、各種干細(xì)胞、iPS 細(xì)胞等），無需提RNA，可直接進(jìn)行qPCR表達(dá)分析，用時(shí)短，操作簡單，出錯(cuò)率低，最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達(dá)分析等步驟。試劑盒中包含反轉(zhuǎn)錄以及定量檢測試劑，可輕松地進(jìn)行基因表達(dá)分析。
產(chǎn)品信息
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貨號(hào) |
11173ES40 / 11173ES60 |
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規(guī)格 |
40 T / 100 T |
組分信息
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
11173ES40 |
11173ES60 |
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11173-A |
FCD Lysis Buffer* |
2 mL |
5 mL |
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11173-B |
FCD Washing Buffer* |
8 mL |
20 mL |
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11173-C |
FCD Stop Solution* |
100 μL |
250 μL |
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11173-D |
DNase I* |
80 μL |
200 μL |
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11173-E |
4× Hifair® FCD RT Mix* |
200 μL |
500 μL |
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11173-F |
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix* |
2 mL |
5 mL |
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11173-G |
RNase Free H2O |
2 mL |
5 mL |
*當(dāng)使用不夠時(shí)，可另外購買Lysis set(Cat#16814ES)、RT set(Cat#16815ES)、qPCR set(Cat#16816ES)。
儲(chǔ)存條件
11173-A和 11173-B未開封時(shí)請置于-25~-15℃保存，融解后置于4℃保存，注意防止污染，其余組分長期保存時(shí)請于-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
一、裂解產(chǎn)物的制備
- 將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
- 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細(xì)胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
- 各個(gè)孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細(xì)胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
- 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細(xì)胞數(shù)量超過1× 105 cells時(shí)可能會(huì)有裂解殘留物屬正?，F(xiàn)象。
*50 μL裂解體系適配細(xì)胞數(shù)的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells，若細(xì)胞數(shù)量較多，可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同細(xì)胞的離心條件不同，請使用適合于所用細(xì)胞的離心速度進(jìn)行離心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實(shí)驗(yàn)需要，加入裂解液量增大時(shí)需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。
****細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時(shí)，請置于-25~-15℃。
二、反轉(zhuǎn)錄
- 室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：
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組分 |
體積 （μL） |
終濃度 |
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4× Hifair® FCD RT Mix |
5 |
1× |
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裂解產(chǎn)物* |
x |
- |
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RNase-free H2O |
Up to 20 |
- |
表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
*避免吸入細(xì)胞碎片，推薦使用量為2 μl，最大不超過反應(yīng)體系的55%。
- 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：
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反應(yīng)溫度 |
反應(yīng)時(shí)間 |
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37℃ |
5 min |
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85℃ |
5 sec |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用37℃，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進(jìn)行下游qRT-PCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對(duì)qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時(shí)間內(nèi)不進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，可放置于-25~-15℃保存。
三、熒光定量PCR
- 體系配置
使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進(jìn)行）：
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組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
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2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix |
12.5 |
1× |
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Forward Primer (10 μM) |
0.5 |
200 nM |
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Reverse Primer (10 μM) |
0.5 |
200 nM |
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Probe (10 μM) |
0.25-1 |
100-400 nM |
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反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物* |
x |
- |
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RNase-free H2O |
Up to 25 |
- |
表3 qPCR反應(yīng)體系
*高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，可適當(dāng)將模板稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物探針濃度。
- 熒光定量PCR快速擴(kuò)增程序（推薦）
本產(chǎn)品推薦使用快速程序擴(kuò)增，可大大減少反應(yīng)時(shí)間。使用Tm值較低的引物難以擴(kuò)增時(shí)，可額外調(diào)整退火溫度。
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
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預(yù)變性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
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變性 |
95℃ |
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45 |
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退火/延伸** |
60℃ |
10 sec |
表4 qPCR反應(yīng)程序（快速）
**退火/延伸溫度、終延伸時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個(gè)別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。
- 熒光定量PCR常規(guī)擴(kuò)增程序
實(shí)驗(yàn)儀器不滿足快速反應(yīng)時(shí)間時(shí)，也可使用常規(guī)程序進(jìn)行擴(kuò)增。
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
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預(yù)變性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
|
變性 |
95℃ |
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40-45 |
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退火/延伸** |
60℃ |
30 sec |
表5 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）
注意事項(xiàng)
- 使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
- 實(shí)驗(yàn)時(shí)，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
- 本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
- 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
Ver.CN20231207
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