產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行基因定量表達分析（如cell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞、原代培養(yǎng)細胞、各種干細胞、iPS 細胞等），無需提RNA，可直接進行qPCR表達分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達分析等步驟。該產(chǎn)品為探針法細胞直擴RT-qPCR試劑盒的細胞裂解模塊，為補充試劑。
組分信息
|
組分編號 |
組分名稱 |
16814ES40 |
16814ES60 |
|
16814-A |
FCD Lysis Buffer |
2 mL |
5 mL |
|
16814-B |
FCD Washing Buffer |
8 mL |
20 mL |
|
16814-C |
FCD Stop Solution |
100 μL |
250 μL |
|
16814-D |
DNase I |
80 μL |
200 μL |
儲存條件
16814-A和 16814-B未開封時請置于-25~-15℃保存，融解后置于4℃保存，注意防止污染，其余組分長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
一、裂解產(chǎn)物的制備
- 將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
- 將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
- 各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
- 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細胞數(shù)量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正?，F(xiàn)象。
*50 μL裂解體系適配細胞數(shù)的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells，若細胞數(shù)量較多，可適當?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同細胞的離心條件不同，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。
****細胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃。
二、反轉(zhuǎn)錄
- 室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：
|
組分 |
體積 （μL） |
終濃度 |
|
4× Hifair® FCD RT Mix |
5 |
1× |
|
裂解產(chǎn)物* |
x |
- |
|
RNase-free H2O |
Up to 20 |
- |
表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
*避免吸入細胞碎片，推薦使用量為2 μl，最大不超過反應(yīng)體系的55%。
- 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：
|
反應(yīng)溫度 |
反應(yīng)時間 |
|
37℃ |
5 min |
|
85℃ |
5 sec |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用37℃，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進行下游qRT-PCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進行下游實驗，可放置于-25~-15℃保存。
三、熒光定量PCR
- 體系配置
使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進行）：
|
組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
|
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix |
12.5 |
1× |
|
Forward Primer (10 μM) |
0.5 |
200 nM |
|
Reverse Primer (10 μM) |
0.5 |
200 nM |
|
Probe (10 μM) |
0.25-1 |
100-400 nM |
|
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物* |
x |
- |
|
RNase-free H2O |
Up to 25 |
- |
表3 qPCR反應(yīng)體系
*高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴增，可適當將模板稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物探針濃度。
- 熒光定量PCR快速擴增程序（推薦）
本產(chǎn)品推薦使用快速程序擴增，可大大減少反應(yīng)時間。使用Tm值較低的引物難以擴增時，可額外調(diào)整退火溫度。
|
循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
|
預(yù)變性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
|
變性 |
95℃ |
|
45 |
|
退火/延伸** |
60℃ |
10 sec |
表4 qPCR反應(yīng)程序（快速）
**退火/延伸溫度、終延伸時間可根據(jù)實驗要求適當調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。
- 熒光定量PCR常規(guī)擴增程序
實驗儀器不滿足快速反應(yīng)時間時，也可使用常規(guī)程序進行擴增。
|
循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
|
預(yù)變性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
|
變性 |
95℃ |
|
40-45 |
|
退火/延伸** |
60℃ |
30 sec |
表5 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）
注意事項
- 使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
- 實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
- 本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時應(yīng)避免強光照射。
- 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
Ver.CN20231207
推薦商品
