產(chǎn)品簡介

 

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行RNA提?。ㄈ鏲ell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞、原代培養(yǎng)細胞、各種干細胞、iPS 細胞等），無需提RNA，可直接進行qPCR表達分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5小時就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達分析等步驟。試劑盒中包含反轉(zhuǎn)錄以及熒光檢測試劑，可輕松地進行基因表達分析。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號	11172ES40 / 11172ES60
規(guī)格	40 T / 100 T

 

組分信息

 

組分編號	組分名稱	11172ES40	11172ES60
11172-A	FCD Lysis Buffer*	2 mL	5 mL
11172-B	FCD Washing Buffer*	8 mL	20 mL
11172-C	FCD Stop Solution*	100 μL	250 μL
11172-D	DNase I*	80 μL	200 μL
11172-E	4× Hifair® FCD RT Mix*	200 μL	500 μL
11172-F	2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix*	2 mL	5 mL
11172-G	RNase Free H2O	2 mL	5 mL

*當使用不夠時，可另外購買Lysis set(Cat#16811ES)、RT set(Cat#16812ES)、qPCR set(Cat#16813ES)。

 

儲存條件

 

11172-A和 11172-B未開封時請置于-25~-15℃保存，融解后置于4℃保存，注意防止污染，其余組分長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期6個月。

 

使用說明

 

一、裂解產(chǎn)物的制備

1. 將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導致反應(yīng)性能下降。
2. 將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
3. 各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細胞數(shù)量超過1× 10⁵ cells時可能會有裂解殘留物屬正?，F(xiàn)象。

*50 μL裂解體系適配細胞數(shù)的基本要求是每孔1× 10⁴，該試劑盒可使用范圍是1 × 10³ - 1 × 10⁶ cells，若細胞數(shù)量較多，可適當?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同細胞的離心條件不同，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。

****細胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃。

二、反轉(zhuǎn)錄

1. 室溫融化4× Hifair^® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：

組分	體積 （μL）	終濃度
4× Hifair® FCD RT Mix	5	1×
裂解產(chǎn)物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

*避免吸入細胞碎片，推薦使用量為2-5 μl，最大不超過反應(yīng)體系的45%。

2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：

反應(yīng)溫度	反應(yīng)時間
55℃	15 min
85℃	5 min

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序

**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用55℃，對于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到 60℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進行下游RT-qPCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進行下游實驗，可放置于-25~-15℃保存。

三、熒光定量PCR

1. 體系配置

使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進行）：

組分	體積（μL）	終濃度
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix	10	1×
Forward Primer (10 μM)	0.4	200 nM
Reverse Primer (10 μM)	0.4	200 nM
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

表3 qPCR反應(yīng)體系

*反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加入量不要超過RT-qPCR體積的1/10。高濃度模板易導致非特異擴增，適當稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL，盡量不要超過6 μL。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。

2. 熒光定量PCR常規(guī)擴增程序（推薦）

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	30 sec	1
變性	95℃	10 sec	35-40
退火/延伸	60℃	30 sec
熔解曲線階段	儀器默認設(shè)置		1

表4 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）

3. 熒光定量PCR快速擴增程序

實驗條件允許時，也可使用快速程序進行擴增。

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	10 sec	1
變性	95℃	5 sec	40
退火/延伸**	60℃	10 sec
熔解曲線階段	儀器默認設(shè)置		1

表5 qPCR反應(yīng)程序（快速）

**退火/延伸溫度、終延伸時間可根據(jù)實驗要求適當調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。

 

注意事項

 

1. 使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
2. 實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
3. 本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時應(yīng)避免強光照射。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

 

Ver.CN20231207