Animal Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 動(dòng)物組織直接PCR試劑盒
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產(chǎn)品說明書
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COA
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產(chǎn)品簡介
動(dòng)物組織直接PCR試劑盒是一款可直接對(duì)不同動(dòng)物組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒，適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡易。本試劑盒采用獨(dú)特的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解多種動(dòng)物組織樣品并釋放出基因組DNA，如昆蟲足翅、鼠尾、鼠趾、動(dòng)物皮膚和內(nèi)臟等。裂解產(chǎn)物可以用于DNA提取純化、也可以直接用于PCR反應(yīng)、也可以在-20℃或以下溫度條件下長期保存?zhèn)溆谩?/font>
本試劑盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)具有很強(qiáng)的擴(kuò)增兼容性，不需要額外采用純化提取試劑去除裂解產(chǎn)物中的各種殘骸雜質(zhì)，能直接以待測樣品裂解液為模板，進(jìn)行高效特異性擴(kuò)增。該試劑為2倍濃縮PCR反應(yīng)混合液，包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，大大簡化擴(kuò)增步驟的操作過程，降低污染機(jī)率。
該試劑盒可用于動(dòng)物基因擴(kuò)增檢測、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因型鑒定等。
組分信息
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
10184ES50 |
10184ES70 |
儲(chǔ)存條件 |
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10184-A |
Lysis Buffer |
10 mL |
4×10 mL |
2-8℃ |
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10184-B |
Proteases |
100 μL |
400 μL |
-25~-15℃ |
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10184-C |
2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye) |
500 μL |
1×2 mL |
-25~-15℃ |
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10184-D |
5×PCR Enhancer |
200 μL |
800 μL |
-25~-15℃ |
a）Lysis Buffer和 Proteases兩種組分配合使用于動(dòng)物組織裂解。
b）2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)包含PCR擴(kuò)增所需要的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等；已混有溴酚藍(lán)染料作為電泳指示劑，PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行電泳。
c）5×PCR Enhancer：高GC含量擴(kuò)增（如大于65%）時(shí)，建議使用5×PCR Enhancer。
儲(chǔ)存條件
1. 試劑10184-A【Lysis Buffer】為動(dòng)物組織裂解緩沖液，建議保存于2-8℃。
2. 試劑10184-B【Proteases】為動(dòng)物組織裂解劑，使用時(shí)請(qǐng)勿長久開蓋，建議保存于-25~-15℃，避免反復(fù)凍融。
3. 試劑10184-C【2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)】，建議保存于-25~-15℃，避免反復(fù)凍融。
4. 試劑10184-D【5×PCR Enhancer】，建議保存于-25~-15℃，避免反復(fù)凍融。
試劑盒有效期1年。
使用說明
- 在離心管中加入200 μL Lysis Buffer和2 μL Proteases，輕輕渦旋混勻。
- 取約10 mg（長度2 mm左右）動(dòng)物組織，置于上述離心管中，輕輕渦旋混勻。
- 55℃孵育5-30 min，然后95℃處理5 min。
- 12,000 rpm離心2 min。
- 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，-20℃保存或直接用于PCR擴(kuò)增。
【注】
a）Lysis Buffer與Proteases混合后盡快使用，不宜長期保存；大量樣本操作時(shí)，可以將Lysis Buffer與Proteases按100 μL:1 μL的比例混勻備用。
b）組織應(yīng)取少量并盡量剪碎，以便裂解反應(yīng)更順利進(jìn)行。各組織推薦使用量：鼠尾：長度2-4 mm；鼠趾：1-4個(gè)；鼠臟器、腦：直徑2-4 mm；斑馬魚、線蟲、果蠅等昆蟲組織：1-4個(gè)；細(xì)胞數(shù)量:105-108個(gè)。斑馬魚、線蟲、果蠅等較小樣本的組織，可適當(dāng)減少Lysis Buffer至50-100 μL。昆蟲等外殼堅(jiān)硬的樣本，建議剪碎樣本并增加Proteases至4 μL。
c）55℃孵育，一般5 min即可滿足多數(shù)PCR需求，如鼠尾、鼠耳等組織；若需要的DNA量較大或樣品較難裂解，可將時(shí)間延長至30 min或更久；裂解時(shí)間可在5-30 min之間調(diào)整，組織塊不需完全裂解，殘余的部分在后續(xù)離心步驟中可被除去。
- 推薦PCR反應(yīng)體系
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組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
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2×Tissue Direct PCR Mix（With Dye） |
10 |
1× |
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Forward Primer（10 μM） |
0.5 |
0.25 μM |
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Reverse Primer（10 μM） |
0.5 |
0.25 μM |
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裂解產(chǎn)物（DNA模板） |
2 |
- |
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無菌超純水 |
To 20 |
- |
表1 PCR反應(yīng)體系
【注】：各組分使用前應(yīng)充分混勻。
a）模板使用量：建議總體系的5-20%之間，避免超過總體系的20%。
b）引物終濃度：反應(yīng)性能較差時(shí)，推薦在0.1- 0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
c）反應(yīng)體系：推薦使用20 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。
d）體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時(shí)離心將反應(yīng)液集于管底。
e）對(duì)照反應(yīng)：建議進(jìn)行PCR時(shí)，設(shè)置陽性和陰性PCR對(duì)照反應(yīng)以便于排除假陽性或假陰性的干擾。
- 反應(yīng)程序
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
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預(yù)變性 |
94℃ |
5 min |
1 |
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變性 |
94℃ |
10 sec |
35 |
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退火* |
60℃ |
20 sec |
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延伸** |
72℃ |
20 sec |
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終延伸 |
72℃ |
5 min |
1 |
表2 PCR反應(yīng)程序
*退火溫度：請(qǐng)參考引物的理論Tm值，退火溫度可設(shè)置低于引物理論值5℃，或通過梯度PCR確定最佳溫度。
注意事項(xiàng)
- 建議使用新鮮采取的動(dòng)物組織，若為長期冷凍組織，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致模板的降解，影響PCR效率。
- 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
常見問題與解決方法
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常見問題 |
可能原因 |
解決方法 |
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陽性對(duì)照、待測樣本均無條帶。 |
PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。 |
使用梯度PCR摸索PCR最佳反應(yīng)條件。 |
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PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。 |
2×PCR Mix應(yīng)保存于-25~-15℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在2-8℃短時(shí)間存放。 |
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引物設(shè)計(jì)問題。 |
嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。 |
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陽性對(duì)照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。 |
不當(dāng)儲(chǔ)存或長期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。 |
使用新鮮的試劑。 |
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加入組織裂解液過量。 |
增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。 |
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樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。 |
裂解混合液可在2-8℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。 |
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模板加入量不適合。 |
在反應(yīng)體系5-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。 |
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PCR循環(huán)數(shù)不足。 |
適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。 |
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非特異性擴(kuò)增 |
PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。 |
提高PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。 |
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PCR引物錯(cuò)配。 |
重新設(shè)計(jì)PCR引物。 |
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配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。 |
PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 |
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陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶 |
操作工具或試劑污染。 |
實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。 |
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樣本間交叉污染。 |
每個(gè)取樣器只對(duì)一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
Ver.CN20241029
