本試劑盒可直接快速地對小鼠組織（如鼠尾、鼠耳、鼠趾等）樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具有極強(qiáng)的樣本兼容性。本試劑盒配備了強(qiáng)力的裂解緩沖液，可以快速裂解樣品，釋放基因組DNA。裂解產(chǎn)物可以直接加入到PCR反應(yīng)體系中，無需精提純化，操作方便。此外，本試劑盒對樣品投入量要求低，2-5 mm2鼠耳或肝臟、1-5 mm鼠尾、1-2個腳趾均可進(jìn)行實驗。

本試劑盒提供的2× Hieff® Tissue Direct PCR Mix為2倍濃度的熱啟動PCR反應(yīng)液，包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。

該試劑盒可用于轉(zhuǎn)基因鑒定、小鼠基因分型等。

 

產(chǎn)品組分

編號	組分	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		10189ES20 （20 T）	10189ES50 （50 T）	10189ES70 （200 T）	10189ES76 （500 T）
10189-A	Lysis solution a	5 mL	12 mL	4× 12 mL	10× 12 mL
10189-B	Proteinase K (20 mg/ml)	250 μL	625 μL	2× 1.25 mL	5× 1.25 mL
10189-C	2× Hieff® Tissue Direct PCR Mix b	500 μL	1.25 mL	5× 1 mL	10× 1.25 mL

a) Lysis solution為裂解液，請戴手套操作。
b) 2× Hieff^® Tissue Direct PCR Mix：包含熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、4 mM Mg²⁺、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑等。

 

運(yùn)輸方法

干冰運(yùn)輸。

 

保存方法
1. 組分A：2-8℃保存，有效期1年。若長時間多次使用，請分裝后儲存，避免交叉污染。
2. 組分B/C：-20℃保存，避免反復(fù)凍融。有效期1年。

 

操作方法

樣品基因組DNA釋放

1. 剪取2-5 mm²鼠耳或肝臟組織，或1-5 mm鼠尾、或1-2個腳趾，置于1.5 mL離心管中；

2. 在上述離心管中加入200 μL Lysis solution和10 μL Proteinase K，輕輕渦旋混勻，使得樣品完全被浸潤，短暫離心；

3. 在恒溫孵育儀中70℃孵育10 min；

4. 孵育完成后，將樣品置于95℃或者沸水浴中加熱5 min滅活Proteinase K;

5. 將裂解產(chǎn)物渦旋振蕩充分混勻后，12000 rpm (13400× g)離心10 min；

6. 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，-20℃保存不超過48小時或直接取上清用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

【注】：1. 組織應(yīng)盡量剪碎，以便裂解反應(yīng)更順利進(jìn)行。

2. 70℃孵育，一般10 min即可滿足多數(shù)PCR需求。若需要的DNA量較大或樣品較難裂解，可將時間延長至20-30 min。組織塊不需完全裂解，殘余的部分在后續(xù)離心步驟中可被除去。

PCR反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	終濃度
2× Hieff® Tissue Direct PCR Mix	25	1×
Forward Primer (10 μM)	2	0.4 μM
Reverse Primer (10 μM)	2	0.4 μM
裂解產(chǎn)物	1-5	-
ddH2O	補(bǔ)足至 50 μL	-

【注】：各組分使用前應(yīng)充分混勻。
a) 模板使用量：50 μL體系建議初步采用2 μL上清液作為模板起始投入量，若產(chǎn)物量較少，可適當(dāng)增加模板投入量；
b) 引物終濃度：0.2-0.4 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度；
c) 反應(yīng)體系：推薦使用50 μL，也可根據(jù)使用習(xí)慣調(diào)整體系體積大??；
d) 體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應(yīng)液集于管底。

PCR反應(yīng)程序

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	35
退火	60℃	15 sec
延伸	72℃	3-10 sec/kb
終延伸	72℃	5 min	1

【注】：a) 退火溫度：請參考引物的理論Tm值，退火溫度可設(shè)置低于引物理論值 2-5℃。

b) 延伸時間：1-4 kb用3-10 s/kb，4 kb以上用20 s/kb。

c) 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：35個循環(huán)已可以擴(kuò)增足量產(chǎn)物。

d) 電泳上樣：取5-7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣即可。

對照反應(yīng)

在PCR結(jié)果分析時，不管是陽性結(jié)果或陰性結(jié)果，如果沒有對照反應(yīng)，都不能確定結(jié)果是否可靠。為了便于后續(xù)實驗結(jié)果的分析，建議在進(jìn)行PCR時，設(shè)置陽性（小鼠基因組DNA）和陰性（通常為生理鹽水）PCR對照反應(yīng)以便于排除假陽性或假陰性的干擾。

注意事項
1. 為了避免樣本間交叉污染，每次取樣后都需要將取樣器材的刃口或與樣本直接接觸的部位浸入2%次氯酸鈉溶液或75%酒精中，反復(fù)洗刷數(shù)次進(jìn)行清洗，然后用干凈的紙巾擦干殘余液體后再進(jìn)行使用。為了試驗方便，也可準(zhǔn)備多個取樣器材，在使用完后進(jìn)行統(tǒng)一清洗，確保每一單獨樣本均使用的是無污染的取樣器材。

2. 建議使用新鮮采取的動物組織，若為長期冷凍組織，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，否則會導(dǎo)致模板的降解，影響PCR效率。
3. 建議擴(kuò)增片段長度6 kb以內(nèi)，以便擴(kuò)增效率最佳。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

常見問題與解決方法

常見問題	可能原因	解決方法
陽性對照、待測樣本均無條帶。	PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反應(yīng)條件。
	PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。	2× Mouse Direct PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。
	引物設(shè)計問題。	嘗試重新設(shè)計引物進(jìn)行檢查。
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。	不當(dāng)儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。	使用新鮮的試劑。
	加入組織裂解液過量。	增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。
	樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。
	模板加入量不適合。	在反應(yīng)體系1-10%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。
	PCR循環(huán)數(shù)不足。	增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因為模板復(fù)雜，PCR反應(yīng)要比用純化的DNA模板多5-10個循環(huán)為佳。
非特異性擴(kuò)增	PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。	增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。
	PCR引物錯配。	重新設(shè)計PCR引物。
	配制PCR反應(yīng)體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。	PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
陰性對照出現(xiàn)目的條帶	操作工具或試劑污染。	實驗所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
	樣本間交叉污染。	每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。

HB220926