產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)植物組織直接PCR試劑盒是一款可直接對(duì)不同類型植物葉片進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒，適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)。試劑盒采用獨(dú)特的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解多種植物樣品并釋放出基因組DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代謝產(chǎn)物等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應(yīng)。此外，樣品使用量少，低至1 mm植物葉片即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒中提供的2× Plant Master Mix具有很強(qiáng)的擴(kuò)增兼容性，能直接以待測(cè)樣品裂解液為模板，進(jìn)行高效特異性擴(kuò)增。該試劑為2倍濃縮PCR反應(yīng)混合液，包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，大大簡(jiǎn)化操作過(guò)程，降低污染幾率。且含有示蹤染料，PCR產(chǎn)物可直接電泳。

該試劑盒可用于轉(zhuǎn)基因植株鑒定、植物基因分型等。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號(hào)	10187ES05 / 10187ES50 / 10187ES70
規(guī)格	5 T / 50 T / 200 T

 

組分信息

 

組分編號(hào)	組分名稱	10187ES05	10187ES50	10187ES70	儲(chǔ)存條件
10187-A	Buffer P1	250 μL	1.25 mL × 2	5 mL × 2	2-8℃
10187-B	Buffer P2	50 μL	500 μL	1 mL × 2	2-8℃
10187-C	2 × Plant Master Mix*	50 μL	500 μL	1 mL × 2	-25~-15℃

*2× Plant Master Mix：包含熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等，同時(shí)包含電泳Loading Buffer，PCR完成之后可直接電泳。

 

儲(chǔ)存條件

 

1. 試劑10187-A【Buffer P1】，置于2-8℃保存。有效期1年。

2. 試劑10187-B【Buffer P2】，中和裂解產(chǎn)物，利于更長(zhǎng)時(shí)間保存樣本，置于2-8℃保存。有效期1年。

3. 試劑10187-C【2 × Plant Master Mix】，-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融。有效期1年。

試劑盒有效期1年。

 

使用說(shuō)明

 

1.植物葉片

1）研磨裂解法：

a. 研磨儀破碎：將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，用研磨儀加鋼珠（鋼珠直徑3 mm左右，共2個(gè)）破碎葉片（45 Hz，1 min），葉片破碎后溶液呈現(xiàn)綠色，瞬時(shí)離心，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆?，? μL用于PCR擴(kuò)增。

b. 槍頭搗碎：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，用槍頭將葉片搗碎，搗碎后溶液呈現(xiàn)綠色，瞬時(shí)離心，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆茫? μL用于PCR擴(kuò)增。

2）加熱裂解法：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，95℃加熱5-10 min（確保裂解液完全浸沒(méi)葉片），較難裂解的葉片（老葉片）可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間（10-20 min），加熱裂解后溶液呈現(xiàn)綠色，震蕩混勻，瞬時(shí)離心，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆茫? μL用于PCR擴(kuò)增。

3）直接法：推薦使用幼嫩葉片。使用打孔器或者刀，將直徑1 mm左右的葉片直接加入到PCR反應(yīng)體系中；復(fù)雜樣本或者是長(zhǎng)片段的擴(kuò)增，推薦使用直徑<1 mm的葉片。

2.PCR反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	體積（μL）	終濃度
2× Plant Master Mix	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
裂解產(chǎn)物（DNA模板）	1	2	-
ddH2O	To 20	To 50	-

表1 反應(yīng)體系

*各組分使用前應(yīng)充分混勻。

1）模板加入量：小于PCR反應(yīng)體系的5%，過(guò)多會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)，強(qiáng)烈推薦加入1 μL模板。葉片直擴(kuò)優(yōu)先推薦研磨儀裂解法。

2）引物終濃度：0.2-0.25 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時(shí)，可在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。

3）反應(yīng)體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

4）體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時(shí)離心將反應(yīng)液集于管底。

5）對(duì)照反應(yīng)：建議進(jìn)行PCR時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性和陰性PCR對(duì)照反應(yīng)以便于排除假陽(yáng)性或假陰性的干擾。

6）為了更穩(wěn)定的保存裂解后的模板，將轉(zhuǎn)移出來(lái)的上清液，按照裂解產(chǎn)物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合，混勻后-20℃保存，穩(wěn)定保存隨時(shí)間和樣本狀態(tài)不同而有所不同。如果處理后的植物葉片上清液一周內(nèi)用于PCR擴(kuò)增，不用加Buffer P2，上清液請(qǐng)保存在-20℃。

3.反應(yīng)條件

循環(huán)步驟	溫度（°C）	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	94	5 min	1
變性	94	10 sec	35
退火*	50-65	20 sec
延伸**	72	1 min/kb
終延伸	72	5 min	1
表2 反應(yīng)條件

*退火溫度：請(qǐng)參考引物的理論 Tm 值，退火溫度可設(shè)置低于引物理論值 2-5℃。

**延伸時(shí)間：需要根據(jù)片段的長(zhǎng)度來(lái)確定，對(duì)于1 kb以內(nèi)的DNA片段，建議延長(zhǎng)時(shí)間為1 min。

 

 

注意事項(xiàng)

 

1. 做葉片實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議使用新鮮采取的葉片組織，若為長(zhǎng)期冷凍組織，需-80℃保存，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，以免造成模板降解，影響PCR效率。葉片組織以幼嫩為宜，若為成熟的葉片，避免使用葉片主脈部位組織。
2. 建議擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1 kb以內(nèi)，以便擴(kuò)增效率最佳。
3. 取樣時(shí)使用打孔器或者刀取適宜大小的樣本，樣本不同時(shí)，打孔器或者刀每次處理樣本前需清洗干凈。
4. 對(duì)于葉片組織，建議取1-10 mm的葉片，過(guò)小會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)量低，過(guò)多會(huì)抑制PCR反應(yīng)，采用加熱裂解法、槍頭搗碎、研磨儀破碎的方式處理植物葉片，處理后需震蕩離心，務(wù)必取上清液試驗(yàn)，沉淀會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)。
5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
6. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法

 

常見(jiàn)問(wèn)題	可能原因	解決方法
陽(yáng)性對(duì)照、待測(cè)樣本均無(wú)條帶。	PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反應(yīng)條件。
	PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。	2×PCR Mix應(yīng)保存于-25~-15℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在2-8℃短時(shí)間存放。
	引物設(shè)計(jì)問(wèn)題。	嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。
陽(yáng)性對(duì)照有目的條帶，待測(cè)樣本無(wú)條帶或條帶弱。	不當(dāng)儲(chǔ)存或長(zhǎng)期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。	使用新鮮的試劑。
	裂解液、中和液加入比例不當(dāng)，裂解混合液影響PCR體系的pH值。	正常條件下，中和后的裂解混合液的pH應(yīng)該在7-8左右（裂解產(chǎn)物和Buffer P2嚴(yán)格按照5:1的量進(jìn)行中和）。
	樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過(guò)久，DNA基因組已經(jīng)降解。	裂解混合液可在2-8℃保存5天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。
	模板加入量不適合。	在反應(yīng)體系＜5%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。
	PCR循環(huán)數(shù)不足。	適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。
非特異性擴(kuò)增	PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。	提高PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。
	PCR引物錯(cuò)配。	重新設(shè)計(jì)PCR引物。
	配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。	PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶	操作工具或試劑污染。	實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。
	樣本間交叉污染。	每個(gè)取樣器只對(duì)一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。

 

 

 

Ver.CN20250304