Hifair? AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit
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產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit是基于Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit開發(fā)的快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，適用于PCR擴(kuò)增以及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。與Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit相比，具有穩(wěn)定的檢出率、特異性、產(chǎn)量保證，且反轉(zhuǎn)錄總時(shí)長最快可低于6分鐘，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
該試劑盒包含gDNA Digester Mix，可去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，保證后續(xù)結(jié)果更加可靠。該試劑盒提供兩種cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)18，用戶可根據(jù)需要，選擇Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成的單鏈cDNA產(chǎn)物可直接用來進(jìn)行后續(xù)PCR或者qPCR反應(yīng)。
產(chǎn)品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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11149ES10（10 T） |
11149ES60（100 T） |
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11149-A |
4× Hifair®AdvanceFast SuperMix |
50 μL |
500 μL |
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11149-B |
5×gDNA Digester Mix |
20 μL |
200 μL |
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11149-C |
Random Primers（50μM） |
20 μL |
200 μL |
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11149-D |
Oligo d(T)18 Primers（50μM） |
20 μL |
200 μL |
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11149-E |
RNase-free Water |
200 μL |
1 mL* 2 |
運(yùn)輸和保存方法
冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期12個(gè)月。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)反應(yīng)，也可-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
第一鏈cDNA合成操作步驟
一、若實(shí)驗(yàn)需要去除殘留基因組DNA
1. gDNA消化
在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。
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組分 |
使用量 |
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RNase-free H2O |
To 10 μL |
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5×gDNA Digester Mix |
2 μL |
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Total RNA |
10 pg -5 μg* |
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or mRNA |
10 pg-500 ng* |
2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）
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組分 |
使用量 |
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上一步的反應(yīng)液 |
10 μL |
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4×Hifair®AdvanceFast SuperMix |
5 μL |
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Oligo d(T)18 Primers（50μM） |
2 μL |
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or Random Primers (* for qPCR)（50μM） |
or 2 μL |
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or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
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RNase-free Water |
To 20 μL |
【注】：1）引物投入量可根據(jù)模板投入量調(diào)整，如果逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于qPCR實(shí)驗(yàn)，推薦Oligo (dT)18與Random Primers 1:1混合使用。
2）建議先加入4×Hifair®AdvanceFast SuperMix 混勻后再加入逆轉(zhuǎn)錄引物，以保證引物不受gDNA Digester影響。
3）體系配制完成后，請用移液器輕輕吹打混勻。
3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置
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溫度 |
時(shí)間 |
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55℃ |
5 min |
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85℃ |
5 s |
二、若實(shí)驗(yàn)無需去除基因組DNA
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）
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組分 |
使用量 |
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4×Hifair®AdvanceFast SuperMix |
5 μL |
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Oligo d(T)18 Primers（50μM） |
2 μL |
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or Random Primers (* for qPCR) （50μM） |
or 2 μL |
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or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
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Total RNA |
10 pg -5 μg |
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or mRNA |
10 pg - 500 ng |
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RNase-free Water |
To 20 μL |
2. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置
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溫度 |
時(shí)間 |
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55℃ |
5 min |
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85℃ |
5 s |
【注】： 1）建議Total RNA的投入量不超過2 μg。如果目的基因的表達(dá)豐度低，可增加投入量至最多5μg Total RNA。
2）對于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到60℃。
3）本產(chǎn)品可合成14 kb以下的cDNA序列，如需得到更長的cDNA產(chǎn)物，可適當(dāng)延長逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間。
注意事項(xiàng)
1）所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行，且操作過程應(yīng)避免RNase污染。
2）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3）本產(chǎn)品僅作科研用途！
HB221108
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