產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
Hieff NGS® ds-cDNA Synthesis Kit是用于Illumina®/MGI®測序平臺的RNA測序文庫的cDNA合成試劑盒，包含高效RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)ds-cDNA合成試劑。可銜接Hieff NGS® OnePot cDNA&gDNA Library Prep Kit（Yeasen Cat#13502）進(jìn)行后續(xù)建庫。本試劑盒提供的所有試劑都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗證，最大程度上保證了文庫構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
產(chǎn)品組分
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組分編號和名稱 |
13488ES08 |
13488ES24 |
13488ES96 |
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13488-A |
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Random Primer |
8 μL |
24 μL |
96 μL |
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13488-B |
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1st Reaction Buffer |
64 μL |
192 μL |
786 μL |
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13488-C |
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1st Strand Enzyme Mix |
16 μL |
48 μL |
192 μL |
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13488-D |
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2nd Reaction Buffer |
56 μL |
168 μL |
672 μL |
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13488-E |
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2nd Strand Enzyme Mix |
24 μL |
72 μL |
288 μL |
運輸與保存方法
干冰運輸。-20℃保存。有效期1年。
注意事項
關(guān)于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。
4. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。
5. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時對各實驗區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
6. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
自備材料（Other Material）
1. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure® XP Beads（A63880）或其他等效產(chǎn)品。
2. 文庫質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫定量試劑。
3. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。
使用方法
Step 1 RNA變性
1. 將 Random Primer 室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。按照下表配置反應(yīng)液：
表1 RNA預(yù)變性反應(yīng)體系
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名稱 |
體積（μL） |
|
Random Primer |
1 |
|
RNA |
14 |
|
Total |
15 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表2所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行RNA的預(yù)變性。
表2 RNA預(yù)變性反應(yīng)程序
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溫度 |
時間 |
|
熱蓋 75°C |
On |
|
70°C |
5 min |
|
立即置于冰上 |
3 min |
Step 2 第一鏈cDNA的合成（1st Strand Synthesis）
1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，室溫解凍，顛倒混勻后瞬離。按表3所示，配制第一鏈cDNA合成的反應(yīng)液。
表3 第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系
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名稱 |
體積（μL） |
|
變性的RNA |
15 |
|
1st Reaction Buffer |
8 |
|
1st Srtand Enzyme Mix |
2 |
|
Total |
25 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表4所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。
表4第一鏈cDNA合成反應(yīng)程序
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溫度 |
時間 |
|
熱蓋 105°C |
On |
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25°C |
5 min |
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42°C |
30 min |
|
85°C |
5 min |
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4°C |
Hold |
Step 3第二鏈cDNA的合成（2nd Strand Synthesis）：
1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表5所示，配制第二鏈cDNA合成反應(yīng)液。
表5第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系
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名稱 |
體積（μL） |
|
1st Strand cDNA |
25 |
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2nd Reaction Buffer |
7 |
|
2nd Strand Enzyme Mix |
3 |
|
Total |
35 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表6所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。
表6 第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序
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溫度 |
時間 |
|
熱蓋 |
Off |
|
16°C |
5 min |
|
4°C |
Hold |
Step 4
第二鏈cDNA產(chǎn)物可銜接Hieff NGS® OnePot cDNA&gDNA Library Prep Kit（Yeasen Cat#13502）進(jìn)行后續(xù)建庫。
HB220110
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