核酸提取—我們是認真的
核酸提取大致分為3大部分：破碎、提取、純化。核酸提取是其中很重要的一個環(huán)節(jié)，核酸模板的質(zhì)量很大程度上決定了下游PCR檢測結(jié)果的準確性。在目前的分子診斷實驗室當中，磁珠法提取和硅膠膜離心柱法提取是最常用的兩種提取方法。那么，這兩種提取方法各有什么特點？提取流程與原理又是什么呢？
柱式篇
硅膠膜離心柱法原理：硅膠膜表面的硅醇基團呈弱酸性，其水化后帶負電。當溶液中存在一定濃度的陽離子后，形成的陽離子橋能夠中和DNA和硅醇基團之間的表面負電荷，從而使DNA牢固地吸附在硅膠膜表面。反之，處于低鹽水溶液狀態(tài)下時，由于硅膠膜的硅醇基團與DNA磷酸基團之間的靜電排斥，硅膠膜釋放DNA。
硅膠膜離心柱法核酸提取流程：
硅膠膜離心柱法提取特點：
1、實驗流程操作簡單
2、價格低廉
3、提取濃度效果好，濃度高。
翌圣生物根據(jù)不同樣本的提取方法提供了不同的產(chǎn)品選擇：
|
分類 |
樣本類型 |
產(chǎn)品名稱/貨號 |
|
多類型樣本 |
動物細胞、組織、常規(guī)植物樣本 |
|
|
各類液體樣本 |
||
|
醫(yī)療樣本 |
細胞、組織 |
|
|
血液、血清、血漿 |
||
|
拭子類 |
||
|
醫(yī)療樣本中及培養(yǎng)物中的病毒 |
||
|
植物樣本 |
常規(guī)植物樣本 |
|
|
細菌樣本 |
細菌培養(yǎng)物 |
|
|
真菌樣本 |
真菌培養(yǎng)物 |
|
|
宏基因組樣本 |
土壤中的全微生物 |
|
|
糞便中的全微生物 |
||
|
質(zhì)粒樣本 |
||
|
DNA產(chǎn)物 |
||
Yeasen柱式核酸提取試劑盒數(shù)據(jù)展示：
1.MolPure® Cell/Tissue DNA Kit 細胞/組織DNA提取試劑盒（18700ES）
適用樣本類型
各類動物的肝臟、肌肉等臟器或培養(yǎng)細胞
產(chǎn)品特點
得率高：產(chǎn)量高達40 µg
DNA純度高：無蛋白質(zhì)和RNA污染，可直接用于PCR、酶切和雜交等實驗
快速簡便：無需傳統(tǒng)乙醇沉淀標準操作，全程30min可完成單個樣本核酸提取
安全環(huán)保：無需使用酚、氯仿等有機物抽提
下游應用
動物基因型鑒定、基因克隆等
應用案例
MolPure® Cell/Tissue DNA Kit可用于小鼠基因組提取
取等量的小鼠不同組織，使用MolPure® Cell/Tissue DNA Kit和T品牌同類產(chǎn)品提取基因組DNA，50 μL ddH2O洗脫。并取1 μL洗脫液作為模板，進行擴增實驗。結(jié)果顯示，MolPure® Cell/Tissue DNA Kit提取產(chǎn)量高，提取產(chǎn)物對下游擴增實驗無干擾，可有效擴增4 kb基因。
圖1. 瓊脂糖電泳判定提取的基因組產(chǎn)量
圖2. 瓊脂糖電泳檢測小鼠2 kb和4 kb的擴增條帶
2.MolPure® Plant DNA Kit 植物DNA提取試劑盒（18800ES）
產(chǎn)品信息
MolPure® Plant DNA Kit采用MolPure® DNA Column P1和新型的溶液體系。提取過程不需要用到有毒的酚、氯仿等有機物抽提，也不需要用到耗時的異丙醇或乙醇沉淀。操作簡便，可在30 min內(nèi)完成植物樣品（100 mg新鮮植物組織或20 mg干燥植物樣本）的DNA提取和純化工作。試劑盒內(nèi)的MolPure® DNA Column P1可選擇性吸附核酸，不吸附蛋白質(zhì)、多糖和其它非核酸類物質(zhì)，得到的DNA純度高，可直接用于PCR、酶切和雜交等實驗。
適用樣本類型
擬南芥、小麥、水稻、大豆、玉米、煙草、棉花等植物葉片、根莖、種子等；不建議用于復雜多糖多酚，次級代謝產(chǎn)物多的植物
產(chǎn)品特點
適用性廣：可從多種植物樣品中提取基因組DNA
DNA純度高：無蛋白質(zhì)和RNA污染，可直接用于酶切、PCR、文庫構(gòu)建等實驗
快速簡便：操作過程30 min即可完成
安全環(huán)保：無需使用酚、氯仿等有機物抽提
下游應用
基因型鑒定、基因克隆等
應用案例
MolPure® Plant DNA Kit可用于植物基因組提取
取100 mg的擬南芥和楊樹樹葉，使用MolPure® Plant DNA Kit和T品牌同類產(chǎn)品提取基因組DNA，50 μL ddH2O洗脫。并取1 μL洗脫液作為模板，進行擴增實驗。結(jié)果顯示，MolPure® Plant DNA Kit提取產(chǎn)量高，提取產(chǎn)物對下游擴增實驗無干擾，可有效擴增4 kb基因。
圖1. 瓊脂糖電泳判定提取的基因組產(chǎn)量
圖2. 瓊脂糖電泳檢測擬南芥和楊樹2 kb和4 kb的擴增條帶
3.MolPure® Soil DNA Kit 土壤DNA提取試劑盒（18815ES）
產(chǎn)品信息
MolPure® Soil DNA Kit適用于各類土壤樣品中核酸的提取。樣本預處理采用陶瓷珠和二氧化硅顆?；旌隙傻牟Ａе?，可有效處理真細菌孢子和內(nèi)生孢子，革蘭氏陽性細菌，酵母，藻類，線蟲和真菌等土壤中的各類微生物。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司特有新型材料，配合本公司獨特的裂解液配方可以可在40 min內(nèi)最大限度的回收高純度核酸。提取的DNA純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可適用于各種下游應用實驗，如酶切、PCR等實驗。
適用樣本類型
土壤
產(chǎn)品特點
提取效率高：采用陶瓷珠和二氧化硅顆?；旌隙傻牟Ａе楦咝Я呀狻⑨尫磐寥乐械奈⑸顳NA；
純度高：下游應用不受抑制。
應用案例
MolPure® Soil DNA Kit可用于土壤微生物菌群分析
取4份500 mg河道土壤，使用MolPure® Swab DNA Kit和M品牌同類產(chǎn)品提取基因組DNA，50 μL ddH2O洗脫。并分別取等體積洗脫液和等質(zhì)量的DNA作為模板，擴增大腸桿菌16s rDNA實驗。結(jié)果顯示，MolPure® Swab DNA Kit提取產(chǎn)物純度高，對下游擴增實驗無干擾。
圖1. 瓊脂糖電泳檢測大腸桿菌16s rDNA的擴增條帶
（注：陽性對照為培養(yǎng)的大腸桿菌gDNA；Y1/Y2和M1/M2為1 μL洗脫液，M3/M4為M1/M2稀釋3倍后的洗脫液）
4.質(zhì)粒DNA提取產(chǎn)品選擇指南
|
產(chǎn)品名稱/貨號 |
起始菌液量 |
提取產(chǎn)量 |
質(zhì)粒內(nèi)毒素含量 |
下游應用 |
|
MolPure® 質(zhì)粒小量提取試劑盒（19001ES） |
2-4 mL |
5-20 µg |
- |
分子克隆、酶切、測序文庫構(gòu)建 |
|
MolPure® 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒（19021ES） |
1-10 mL |
20-50 µg |
<0.1 EU/μg DNA |
轉(zhuǎn)染、酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序 |
|
MolPure® 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒（19036ES） |
150-300 mL |
0.5-2 mg |
<0.1 EU/μg DNA |
產(chǎn)品特點
提取產(chǎn)量高、操作簡單快速
應用案例
MolPure® 質(zhì)粒提取試劑盒提取產(chǎn)量高、內(nèi)毒素殘留量低
取150 mL不同大小的質(zhì)粒，使用MolPure® 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒和T品牌同類產(chǎn)品提取質(zhì)粒DNA，1 mL ddH2O洗脫。并取等體積量的洗脫液，跑膠鑒定條帶亮度和內(nèi)毒素殘留檢測。結(jié)果顯示，MolPure® 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒提取質(zhì)粒產(chǎn)量高，內(nèi)毒素殘留低于<0.1 EU/μg DNA。
圖1. 瓊脂糖電泳判定提取的2.6 kb、40 kb及5.7 kb質(zhì)粒產(chǎn)量
|
陰性對照 |
陽性對照 |
Y1-pUC19 |
T- pUC19 |
Y1-40 kb |
T-40 kb |
Y1-pSET152 |
T-pSET152 |
|
|
545 nm吸光度值 |
0.1 |
1.9749 |
2.3596 |
2.3307 |
2.3246 |
2.3134 |
2.3989 |
2.144 |
|
內(nèi)毒素濃度（EU/μg DNA） |
0.0012 |
0.0017 |
0.0011 |
0.0014 |
0.0011 |
0.0016 |
表1. 內(nèi)毒素含量測定
5.MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 細胞/組織總RNA提取試劑盒
產(chǎn)品信息
MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit適用于從多種新鮮或凍存的動物組織或培養(yǎng)細胞中高效率地提取高純度、高質(zhì)量的總RNA。提取過程不需要用到有毒的酚、氯仿等有機物抽提，也不需要用到耗時的異丙醇或乙醇沉淀。操作簡便，30 min即可完成動物組織或細胞（10-20 mg動物組織或(1-5)×106個動物細胞）總RNA的提取純化工作。
產(chǎn)品特點
RNA純度高：配有基因組DNA吸附柱，可有效去除DNA污染
安 全：無需有機溶劑抽提
快速簡便：操作過程30 min完成
使用方便：全流程室溫操作，無需冰浴和低溫離心
應用案例
MolPure® Cell/Tissue RNA Kit提取產(chǎn)量高，純度高
取106個雜交瘤細胞，分別使用MolPure® Cell/Tissue RNA Kit和TRIzol（貨號：10606ES）提取總RNA，50 μL RNase-free H2O洗脫。之后取1 μL洗脫液，測定濃度；取2 μL洗脫液，使用Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR SYBR Green Kit（貨號：11143ES）進行定量測試小鼠GAPDH。結(jié)果顯示，MolPure® Cell/Tissue RNA Kit能穩(wěn)定提取RNA，RNA產(chǎn)量高，完整度較好。
|
濃度（ng/μL） |
OD260/OD280 |
|
|
Y1/Y2 |
733.01 / 851.95 |
1.84 / 1.97 |
|
T1/T2 |
782.01 / 862.16 |
1.728 / 1.809 |
表1. Nanodrop測定RNA濃度
圖1. 一步法反轉(zhuǎn)錄定量結(jié)果顯示，Ct 值并無明顯差異（注：綠色為 MolPure® Cell/Tissue RNA Kit，藍色為 TRIzol）
柱式法核酸提取常見問題分析：
1. A260/280比值較低？或者A260/280比值較高？
用水作為洗脫液比較偏低，或者蛋白質(zhì)殘留，但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。而比較高可能是大量RNA殘留，沒有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差則為苯酚殘留。
2.為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊醇？
在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。
3.凍存細胞與新鮮細胞的RNA提取有區(qū)別嗎？具體該怎么操作？
新鮮細胞與凍存細胞RNA提取沒什么區(qū)別。千萬不能等細胞溶解了存狀態(tài)把Trizol直接加到凍存管了，一起化開，振蕩振蕩就可以了。與從組織中提RNA 差不多。
4.RNA得率低
組織起始量太少或者太多：樣品量過少，則細胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導致RNA得率低。
5.RNA降解：
●提取的材料不新鮮。新鮮組織取得后應立即置于液氮中或立即放入RNAstore試劑中，以保證提取效果。
●處理樣品量過大。
●污染了RNase。 雖然試劑盒中提供的緩沖液都不含RNase，但使用過程中很 容易污染RNase，應小心操作。
磁珠篇
磁珠法吸附原理：運用納米技術(shù)，對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。核酸結(jié)合到磁珠上主要依靠靜電作用、疏水作用和氫鍵作用。在鹽酸胍、異硫氰酸胍和外加磁場的作用下，能從血液樣本中分離出DNA，并洗去非特異性吸附的雜質(zhì)，得到純化后的DNA，可應用于實驗室檢測。磁珠法提取的原理，具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢，可以應用在血液、組織、拭子、鼻咽分泌物等樣本之中。
磁珠法核酸提取流程：
磁珠法特點主要體現(xiàn)在：
1.能夠?qū)崿F(xiàn)自動化、大批量的實驗操作。
2.操作簡單，用時短，整個流程大約可以在30分鐘內(nèi)完成。
3.安全無毒，符合環(huán)保理念。
4.磁珠與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高、濃度大。
隨著疫情的頻發(fā)，翌圣生物迅速響應市場需求，推出了全自動核酸提取儀及配套試劑：
MolPure®磁珠法拭子樣本病毒DNA/RNA提取試劑盒
產(chǎn)品描述
MolPure®磁珠法拭子樣本病毒DNA/RNA提取試劑盒可用于從拭子、病毒培養(yǎng)上清液中分離純化高質(zhì)量的病毒DNA/RNA。通過采用獨特分離作用的磁珠及精心優(yōu)化的緩沖體系高效捕獲釋放的核酸，提取的核酸得率高、質(zhì)量好，適用于各種下游應用實驗，如RT-qPCR，qPCR 等實驗。
產(chǎn)品特點
1. 提取效率高，重復性好，提取靈敏度高達100 copies/mL。
2. 樣本適用性：適用于不同的樣品類型，拭子、血漿等。
3. 儀器適配性：試劑形式多樣化，適用于市售各種全自動核酸提取儀進行高通量提取。
4. 安全無毒：試劑不含酚、氯仿等有毒物質(zhì)。
5. 自主研發(fā)，性價比高，貨期快。
數(shù)據(jù)展示
●提取靈敏度高達100 copies/mL
圖1：Yeasen MolPure®磁珠法拭子樣本病毒DNA/RNA能夠提取100 copies/mL口咽拭子新 冠假病毒，并且提取效率優(yōu)于N*公司同類型產(chǎn)品。
● 重復性好（CV＜5%）
圖2：Yeasen MolPure®磁珠法拭子樣本病毒DNA/RNA提取試劑盒重復性誤差CV＜5%。
樣本：200μL E5 copies/mL 新 冠假病毒。
產(chǎn)品信息
|
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
|
MolPure®Magnetic Swab Viral DNA/RNA Kit 磁珠法拭子樣本病毒DNA/RNA提取試劑盒（瓶裝） |
18300ES60 |
100T |
|
MolPure® Mag32 Swab Viral DNA/RNA Kit FA 磁珠法32孔拭子樣本病毒DNA/RNA提取試劑盒FA（預封裝） |
18301ES32/59 |
2×16/6×16T |
|
MolPure® Mag96 Swab Viral DNA/RNA Kit FR 磁珠法96孔拭子樣本病毒DNA/RNA提取試劑盒FR（預封裝） |
18520ES59 |
96T |
|
MolPure® Magnetic Universal Viral DNA/RNA Kit 磁珠法通用病毒DNA/RNA提取試劑盒（預封板） |
18521ES59 |
96T |
2. MolPure®磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒
產(chǎn)品描述
MolPure®磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒適用于血液樣本的基因組DNA的提取。采用獨特的磁珠和精心優(yōu)化的緩沖體系，可最大限度的分離純化高純度DNA。提取的基因組DNA純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，適用于各種下游應用實驗，如酶切，PCR，qPCR等。
產(chǎn)品特點
1. 提取得率高，純度好，260/280在1.8-2.0之間。
2. 樣本適用性：適用于新鮮血液、凍存血、血細胞等樣本。
3. 儀器適配性：試劑形式多樣化，適用于市售各種全自動核酸提取儀進行高通量提取。
4. 安全無毒：試劑不含酚、氯仿等有毒物質(zhì)。
5. 自主研發(fā)，性價比高，貨期快。
數(shù)據(jù)展示
● 適合各種保存條件下的血液樣本
圖3：Yeasen MolPure®磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒適合各種保存條件血液樣本。
Line 1-2：為新鮮抗凝血液基因組DNA。
Line 3-4：為4℃保存7d的血液基因組DNA。
Line 5-6：為-20℃保存7d的血液基因組DNA。
Line 7-8：為-20℃保存30d的血液基因組DNA。
Line 9-10：為-20℃保存90d的血液基因組DNA。
客戶反饋
● 人新鮮血液DNA提取（來源于：北京某客戶）
|
樣本 |
核酸(ng/uL) |
A260/A280 |
A260/A230 |
|
1 |
129.50 |
1.95 |
2.08 |
|
2 |
176.12 |
1.93 |
2.26 |
|
3 |
91.87 |
1.95 |
2.04 |
|
4 |
101.14 |
1.94 |
2.14 |
|
5 |
164.69 |
1.91 |
2.05 |
|
6 |
138.05 |
1.88 |
2.09 |
|
7 |
102.44 |
1.85 |
2.04 |
|
8 |
192.44 |
1.91 |
2.16 |
表1：Yeasen MolPure®磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒提取人新鮮血液樣本。血液投入量為300 μL，洗脫體積70μL。使用32通道自動化核酸提取儀。結(jié)果：提取結(jié)果優(yōu)于現(xiàn)有產(chǎn)品，滿足客戶的需求。
產(chǎn)品信息
|
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
|
MolPure® Magnetic Blood DNA Kit 磁珠法血液DNA提取試劑盒（瓶裝） |
18351ES60 |
100T |
|
MolPure® Mag32 Blood DNA Kit FA 磁珠法32孔血液DNA提取試劑盒FA（預封裝） |
18352ES32/59 |
2×16/6×16T |
|
MolPure® Mag96 Blood DNA Kit FH 磁珠法96孔血液DNA提取試劑盒FH（預封裝） |
18365ES59 |
96T |
更多核酸提取產(chǎn)品請點擊以下連接：
http://www.jmdlpcb.com/products/max/94
