產(chǎn)品說明書
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COA
已發(fā)表文獻
產(chǎn)品描述
本試劑盒是利用拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase)高效快速連接DNA片段的原理進一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比，具有以下優(yōu)勢：
1）快速，僅需 1-5 min即可完成連接反應(yīng)。
2）高效，無自連，陽性克隆率接近100%，無需設(shè)置藍白斑篩選；
3）操作簡單，從連接到涂板僅需 15-20 min。操作過程省去冰浴、熱激和1 h復(fù)蘇。
4）可連接長達5 kb目的產(chǎn)物；
5）Hieff Clone® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit不含多克隆酶切位點(MCS)，在引入后續(xù)酶切位點進行酶切操作時，不會受到MCS位點的影響，從而增加酶切效率以及克隆成功率。
產(chǎn)品用途
A尾PCR產(chǎn)物的快速克??；克隆后PCR產(chǎn)物的快速測序（使用M13F/M13R引物）。
產(chǎn)品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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10908ES20 （20 T） |
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10908-A |
pESI-T simple vector (30 ng/μL) |
20 μL |
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10908-B |
1 kb control insert (40 ng/μL) |
5 μL |
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10908-C |
10× Enhancer |
20 μL |
運輸和保存方法
冰袋運輸。-20℃保存，避免反復(fù)凍融。有效期一年。
注意事項
1）pESI-T simple vector插入位點兩端不含多克隆酶切位點，需要在PCR設(shè)計引物時引入合適酶切位點。
2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3）本產(chǎn)品僅供科研用途！
使用方法
一、Control DNA片段的克隆實驗
1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10 μL為例。
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組分 |
用量 |
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10 ´ Enhancer |
1 μL |
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1 kb control insert (40 ng/μL) |
1 μL |
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pESI-T simple vector (30 ng/μL) |
1 μL |
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ddH2O |
7 μL |
2）混勻上述體系。于室溫(20-30℃)反應(yīng)5 min。
【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進行。室溫下孵育時，不建議您超過5分鐘；但是，如果您的PCR產(chǎn)物濃度較低或者您要克隆一個長片段，則可以適當延長孵育時間。
3）連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化或于-20℃保存。
4）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。
【注】：a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細胞中（加入體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)。
b）通常使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克，室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。
5）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。
6）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計轉(zhuǎn)化子少，得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。
二、一般DNA片段的克隆實驗
所插入片段為利用常規(guī)Taq酶(Yeasen，Cat#10101-10106)或熱啟動型Taq酶(Yeasen，Cat#10732)擴增得到的含A尾產(chǎn)物，如產(chǎn)物無非特異性條帶、引物二聚體可直接進行連接反應(yīng)，否則建議膠回收后使用。
【注】：a）PCR產(chǎn)物不能磷酸化。
b）如擴增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會在后續(xù)實驗中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進行膠回收后連接。
1）按照下表配制連接體系（以10 μL為例）
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組分 |
用量 |
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10 ´ Enhancer |
1 μL |
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pESI-T simple vector (30 ng/μL) |
1 μL |
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插入片段 |
0.5-8 μL |
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ddH2O |
To 10 μL |
【注】：a）可根據(jù)具體實驗情況按照上述比例調(diào)整反應(yīng)體系。
b）不同的插入片段所用量參考下表：
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插入片段大小 |
推薦用量 |
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0.1-1 kb |
20-50 ng |
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1-2 kb |
50-100 ng |
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2-5 kb |
100-200 ng |
2）混勻上述體系。于室溫(20-30℃)反應(yīng)5 min。
【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進行。室溫下孵育時，不建議您超過5分鐘；但是，如果您的PCR產(chǎn)物濃度較低或者您要克隆一個長片段，則可以適當延長孵育時間。
3）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。
【注】：a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細胞中（加入體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)。
b）通常使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克，室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。
4）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。
【注】：通常商品化的感受態(tài)細胞不超過2 kb插入片段情況下，10 min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率低或者插入片段長轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時間到30-60 min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。
5） 取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。
6）轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定
a) 菌落/菌液PCR鑒定。
b) 質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進行鑒定。
c) 酶切鑒定：根據(jù)克隆實驗設(shè)計，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進行鑒定。
d) 測序分析：可選測序引物序列如下：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC
【注】：本制品陽性率相當高，一般情況下，陽性克隆率接近100%，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就是陽性克隆，因此插入片段在3 kb以內(nèi)時，可不用鑒定，直接挑取1-2個克隆子進行測序分析。
pESI-T simple vector 圖譜
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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10907ES20 |
20 T |
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Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒HOT |
10909ES20 |
20 T |
|
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點） |
10910ES20 |
20 T |
|
10102ES03/08 |
5 mL |
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10106ES03/08 |
1/5×1 mL |
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|
Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶HOT |
10148ES60/76 |
100/500 U |
HB220909
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