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    1. 

          2. 
    
            
           
          產(chǎn)品說明書
                  
          FAQ
                  
          COA
                  
          已發(fā)表文獻(xiàn)
                  
           
          

           
          


          Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit是利用新一代拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase)高效快速連接DNA片段的原理進(jìn)一步研發(fā)而成，搭配高效的平末端化因子，兼容平末端產(chǎn)物及粘性末端產(chǎn)物的快速克隆。與傳統(tǒng)的連接酶相比，具有以下優(yōu)勢：1) 快速，僅需5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2) 高效，無自連現(xiàn)象，陽性克隆率接近100%，無需設(shè)置藍(lán)白斑篩選；3) 可連接長達(dá)5 kb目的產(chǎn)物。
          


           
          


          組分信息
          


          
	
		
          
			
			
          組分編號
          
			          		
			
			
          組分名稱
          
			          		
			
			
          10906ES08
          
			          		
			
			
          10906ES20
          
			          		
			
			
          10906ES50
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          10906-A
          
			          		
			
			
          2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix
          
			          		
			
			
          25 μL
          
			          		
			
			
          100 μL
          
			          		
			
			
          250 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          10906-B
          
			          		
			
			
          1 kb control insert (40 ng/μL)
          
			          		
			
			
          10 μL
          
			          		
			
			
          10 μL
          
			          		
			
			
          10 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          10906-C
          
			          		
			
			
          M13 Forward Primer(10 μM)
          
			          		
			
			
          50 μL
          
			          		
			
			
          200 μL
          
			          		
			
			
          500 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          10906-D
          
			          		
			
			
          M13 Reverse Primer(10 μM)
          
			          		
			
			
          50 μL
          
			          		
			
			
          200 μL
          
			          		
			
			
          500 μL
          
			          		
		
          
	          

          


           
          


          儲存條件
          


          -25~-15℃保存，有效期1年。
          


           
          


          使用說明
          


            
	
          1. 反應(yīng)體系
            2. 

          


          
	
		
          
			
			
          組分
          
			          		
			
			
          用量
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix
          
			          		
			
			
          5 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          插入片段*
          
			          		
			
			
          0.5-5 μL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          ddH2O
          
			          		
			
			
          To 10 μL
          
			          		
		
          
	          

          


          *PCR 產(chǎn)物不能磷酸化。如擴(kuò)增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接。0.1-1 kb片段投入量推薦20-50 ng，1-2 kb片段投入量推薦50-100 ng，2-4 kb片段投入量推薦100-200 ng，4-5 kb片段投入量推薦200-300 ng。
          


            
	
          1. 反應(yīng)條件
            2. 

          


          混勻上述體系，于室溫(20-37℃)反應(yīng)5 min。連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。室溫(20-37℃)下孵育時(shí)，建議孵育時(shí)間不超過5 min，如果PCR產(chǎn)物濃度較低或者片段較長，則可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間，不宜超過15 min（推薦使用25℃，PCR儀控溫）。
          


            
	
          1. 轉(zhuǎn)化
            2. 

          


          1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802ES）。
          


          2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。
          


          3）42℃熱激60 sec，冰上孵育2 min。
          


          4）加入500 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃，200 rpm，搖菌60 min。
          


          5）5000 rpm離心4 min，棄上清至100 μL，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體。用無菌涂布棒將菌液均勻涂抹在含有正確抗性的平板上。待菌液被培養(yǎng)基吸收后，倒置平板，于37℃過夜培養(yǎng)。
          


            
	
          1. 克隆鑒定
            2. 

          


          可選擇測序法或酶切法進(jìn)行鑒定。用無菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。測序引物：
          


          M13F ：GTAAAACGACGGCCAGT
          


          M13R ：CAGGAAACAGCTATGAC
          


           
          


          載體信息
          


          


          

          


           
          


          注意事項(xiàng)
          


            
	
          1. 需自備的材料：
            2. 

          


          1）自備試劑（僅羅列部分）：
          


            
	
          1. 超級感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11802ES）。
            2. 
	
          2. 高保真酶：2× Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10154ES）或其他等效產(chǎn)品。
            3. 
	
          3. 菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產(chǎn)品。
            4. 
	
          4. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產(chǎn)品。
            5. 

          


          2）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等。
          


            
	
          1. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
            2. 
	
          2. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
            3. 

          

             
           
           
           
           
           
           
           
          400-6111-883