產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品描述
細胞增殖檢測是評估細胞健康程度、遺傳毒性及抗腫瘤藥物效果的基礎(chǔ)實驗手段。常用的檢測細胞增殖方法是BrdU
法。EdU法檢測是Brdu方法的升級和突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物可以在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測是基于“點擊”反應(yīng)，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價反應(yīng)。
本試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 488 Azide染料含有疊氮化合物。點擊法的EdU標記增殖快速有效，使用方便，只需少量的疊氮化染料即可非常有效地標記出整合的EdU。標準化的戊二醛固定和去污劑促滲可以使檢測試劑進入細胞，而Brdu方法則需要DNA變性（如酸變性、熱變性或者用DNase消化）去暴露BrdU，從而方便BrdU抗體結(jié)合。本試劑盒包含EdU法檢測所需要的所有組份，可以檢測細胞增殖與細胞周期分析。
光譜特性：Yefluor 488 Azide：Ex/Em=495/519 nm
產(chǎn)品組分
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編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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40278ES25（20T） |
40278ES50（50T） |
保存條件 |
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40278-A |
10 mM EdU |
0.4 mL |
1 mL |
-20 ℃ |
|
40278-B |
Yefluor 488 Azide |
100 µL |
250 µL |
-20 ℃，避光 |
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40278-C |
CuSO4 |
0.8 mL |
2 mL |
2-8℃ |
|
40278-D |
Click-iT EdU緩沖液添加物 |
60 mg |
150 mg |
2-8 ℃ |
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40278-E |
10×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液 |
1 mL×2 |
5 mL |
2-8 ℃ |
注：上述反應(yīng)次數(shù)是按照6孔板培養(yǎng)細胞檢測計算
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。-20 ℃避光保存，有效期1年。開封后，保存溫度請詳見說明書。
注意事項
1）操作時請采取防護措施，穿防護服、戴一次性手套等。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！
其他所需試劑
10 mM PBS, pH 7.2-7.6
中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛in PBS ）
促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）
1% BSA in PBS, pH7.4
使用方法
1、EdU標記
【注】：EdU的標記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 µM的EdU初始濃度進行摸索。細胞培養(yǎng)基、細胞生長密度及細胞類型和其他實驗條件都有可能影響細胞的標記效果。預實驗中，我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細胞的實驗濃度。
1.1按每孔1×105~3×106個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。進行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。
1.2 EdU加入細胞培養(yǎng)基至所需的濃度混勻，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進行摸索。細胞培養(yǎng)基、細胞生長密度及細胞類型和其他實驗條件都有可能影響細胞的標記效果。
1.3以合適時間和條件孵育細胞，EdU孵育細胞的時間可以直接用作測定細胞DNA合成的指標，時間點選擇以及孵育時間的長度取決于細胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進行的脈沖式標記細胞可以用于研究細胞周期動力學。（注意：EdU濃度與孵育時間相關(guān)，短時間孵育(< 2 h)宜采用高濃度，如：10~50 μM，長時間孵育(>24 h)宜采用低濃度，如：1~10 μM）。
2、細胞固定及促滲操作
2.1 孵育完成后，收集細胞，1% BSA in PBS清洗細胞1次，離心收集細胞。
2.2 100 µL 4%多聚甲醛in PBS重懸細胞。
2.3 室溫避光孵育15 min。
2.4 1% BSA in PBS的洗滌液洗滌細胞2次。
2.5 0.1 mL 0.5% Triton X-100促滲液重懸細胞，室溫孵育20 min。
【注】：①本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等等。
②對于需要同時做細胞表面抗原標記的實驗，可以考慮在完成EdU孵育后，以含1% BSA-PBS洗滌2次細胞后，在細胞固定促滲之前進行。
3、EdU檢測
3.1 制備一份5×的Click-iT EdU反應(yīng)添加物儲液（組分D）：加1 mL去離子水至100 mg的D組分試管中（100 mg/mL），
混勻至全部溶解。使用后，剩余儲液存放在≤ -20 ℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分D均按照此比例加去離子水溶解為5×儲液備用）。
3.2 準備1× Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲液（組分D）至1×，溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，當天用完。
3.3 準備1× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液: 10×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液 (組分E) 以去離子水稀釋10倍即可。
3.4 依據(jù)表1準備Click-iT反應(yīng)混合物。【注】表1要求添加的組分對于反應(yīng)來說非常重要，否則反應(yīng)無法有效進行。
表1 Click-iT反應(yīng)混合物
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反應(yīng)組分 |
每單次反應(yīng)所需的加液體積 |
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1× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液（步驟3.3所準備） |
875 μL |
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CuSO4 （組分C） |
20 μL |
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Yefluor 488 Azide（組分B） |
5 μL |
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1×反應(yīng)緩沖液添加物（步驟3.2所準備） |
100 μL |
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總體積 |
1 mL |
3.5 加入1 mL Click-iT反應(yīng)混合物至每管，混勻。
3.6 室溫避光孵育反應(yīng)混合物30 min。
3.7以1% BSA in PBS洗滌細胞一次，收集細胞去除上清，以1 mL含1%BSA的PBS重懸細胞，上機檢測。
注意：對于6孔板收集的細胞樣本可參考每個反應(yīng)需要1 mL的反應(yīng)工作液來進行。用戶可以根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整等比例減少所用的溶液體積。
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品編號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
價格（元） |
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40277ES80 |
1000T |
5383.00 |
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40278ES25 |
20T |
2583.00 |
|
|
40278ES50 |
50T |
5783.00 |
|
|
40279ES25 |
20 T |
2583.00 |
|
|
40279ES50 |
50 T |
5783.00 |
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|
40280ES25 |
20 T |
2583.00 |
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|
40280ES50 |
50 T |
5783.00 |
|
|
40284ES05 |
2 mg |
1783.00 |
HB211123
