產(chǎn)品描述

 

細(xì)胞增殖檢測(cè)是評(píng)估細(xì)胞健康程度、遺傳毒性及抗腫瘤藥物效果的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)手段。最精確的檢測(cè)細(xì)胞增殖方法是BrdU

法。EdU法檢測(cè)試劑盒是Brdu方法的革命性突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物可以在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測(cè)是基于“點(diǎn)擊”反應(yīng)，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價(jià)反應(yīng)。

本試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 594 Azide染料含有疊氮化合物。點(diǎn)擊法的EdU標(biāo)記增殖快速有效，使用方便，只需少量的疊氮化染料即可非常有效地標(biāo)記出整合的EdU。標(biāo)準(zhǔn)化的戊二醛固定和去污劑促滲可以使檢測(cè)試劑進(jìn)入細(xì)胞，而B(niǎo)rdu方法則需要DNA變性（如酸變性、熱變性或者用DNase消化）去暴露BrdU，從而方便BrdU抗體結(jié)合。 本試劑盒包含EdU法檢測(cè)所需要的所有組份，可以檢測(cè)細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期分析。

光譜特性：Yefluor 594 Azide：Ex/Em=594/617 nm；

 

產(chǎn)品組分

 

編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		40279ES25（20 T）	40279ES50（50 T）	保存條件
40279-A	10 mM EdU	0.4 mL	1 mL	-20℃
40279-B	Yefluor 594 Azide	100 µL	250 µL	-20℃，避光
40279-C	CuSO4	0.8 mL	2×1 mL	2-8℃
40279-D	Click-iT EdU緩沖液添加物	60 mg	150 mg	2-8℃
40279-E	10×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液	2×1 mL	5 mL	2-8℃

注：上述反應(yīng)次數(shù)是按照6孔板培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè)計(jì)算

 

運(yùn)輸與保存方法

 

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

 

1）操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴一次性手套等。

2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

他所需試劑

 

10 mM PBS, pH7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛in PBS ）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

1% BSA in PBS, pH7.4

 

使用說(shuō)明

 

1、EdU標(biāo)記

注意：EdU的標(biāo)記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細(xì)胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 µM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長(zhǎng)密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.1按每孔1×10⁵~3×10⁶個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段。進(jìn)行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

1.2 EdU加入細(xì)胞培養(yǎng)基至所需的濃度混勻，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長(zhǎng)密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。

1.3以合適時(shí)間和條件孵育細(xì)胞，EdU孵育細(xì)胞的時(shí)間可以直接用作測(cè)定細(xì)胞DNA合成的指標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)選擇以及孵育時(shí)間的長(zhǎng)度取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。通過(guò)短暫的EdU孵育進(jìn)行的脈沖式標(biāo)記細(xì)胞可以用于研究細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)。（注意：EdU濃度與孵育時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間孵育(<2 h)宜采用高濃度，如：10~50 μM，長(zhǎng)時(shí)間孵育(>24 h)宜采用低濃度，如：1~10 μM）。

2、細(xì)胞固定及促滲操作

2.1 孵育完成后，收集細(xì)胞，1%BSA in PBS清洗細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞

2.2 100 µL 4%多聚甲醛in PBS重懸細(xì)胞。

2.3 室溫避光孵育15 min。

1. 4. 1% BSA in PBS的洗滌液洗滌細(xì)胞2次。
   5. 0.1 mL 0.5% Triton X-100促滲液重懸細(xì)胞，室溫孵育20 min。

注意①.本參考步驟是針對(duì)以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等等。

②.對(duì)于需要同時(shí)做細(xì)胞表面抗原標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，可以考慮在完成EdU孵育后，以含1%BSA-PBS洗滌2次細(xì)胞后，在細(xì)胞固定促滲之前進(jìn)行。

3、EdU檢測(cè)

3.1 制備一份5×的Click-iT EdU反應(yīng)添加物儲(chǔ)液（組分D）：加1 mL去離子水至100 mg的D組分試管中（100 mg/mL），

混勻至全部溶解。使用后，剩余儲(chǔ)液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說(shuō)明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分D均按照此比例加去離子水溶解為5×儲(chǔ)液備用）。

3.2 準(zhǔn)備1× Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲(chǔ)液（組分D）至1×，溶液應(yīng)新鮮配置，當(dāng)天用完。

3.3 準(zhǔn)備1×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液: 10×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液 (組分E) 以去離子水稀釋10倍即可。

3.4 依據(jù)表1準(zhǔn)備Click-iT反應(yīng)混合物。表1要求添加的組分對(duì)于反應(yīng)來(lái)說(shuō)非常重要，否則反應(yīng)無(wú)法有效進(jìn)行。

表1 Click-iT反應(yīng)混合物

反應(yīng)組分	每單次反應(yīng)所需的加液體積
1×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液（步驟3.3所準(zhǔn)備）	875 μL
CuSO4 （組分C）	20 μL
Yefluor 594 Azide（組分B）	5 μL
1×反應(yīng)緩沖液添加物（步驟3.2所準(zhǔn)備）	100 μL
總體積	1 mL