內(nèi)參標簽抗體選擇指南
各位小伙伴，您是否在蛋白免疫印記時，面對各種內(nèi)參抗體而不知所措呢，內(nèi)參蛋白是生物體內(nèi)管家基因編碼的，在多組織中穩(wěn)定表達，用于驗證免疫學實驗中是否正常進行和一種半定量檢測蛋白表達的標準對照，那么如何正確的選擇內(nèi)參抗體呢！可以從以下幾點去參考。
一、樣本種屬來源
1. 哺乳動物組織或著細胞來源的樣本，一般選擇β-actin、α-tubulin、GAPDH、Lamin- B、Histone H3、Na+/K+-ATPase。
2. 植物來源樣本，一般選擇plant actin、Rubisco等。
3. 其他研究較稀少的樣本，通過查詢相關文獻或數(shù)據(jù)庫，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參推薦ICG網(wǎng)站:http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_PageICG
二、目的蛋白分子量
保證目的蛋白分子量與內(nèi)參相差大于5KDa以上，防止檢測時干擾，例如，目的蛋白為40KDa，不宜選擇β-actin（42KDa）作內(nèi)參，可考慮GAPDH (36KDa) 或者β-tubulin(55KDa)作為內(nèi)參。
三、內(nèi)參蛋白表達部位
因此，提取蛋白的部位不同，選擇的內(nèi)參蛋白也不同。比如有時胞質(zhì)、胞核分開提取而不提取總蛋白時，就要選擇相應部位表達的內(nèi)參蛋白。如 H3在細胞核中高效穩(wěn)定表達，理論上在細胞質(zhì)不表達，那么對于胞質(zhì)提取的蛋白，就不能選用H3作為內(nèi)參蛋白，而應該選擇細胞質(zhì)中表達的β-actin 、GAPDH α-Tubulin等作為內(nèi)參蛋白。（內(nèi)參評價推薦軟件geNorm、NormFinder）
|
亞細胞定位 |
內(nèi)參 |
分子量KDa |
注意事項 |
|
胞漿、全細胞 |
β-actin |
42 |
不適用于細胞核提取物，因為β-actin是染色質(zhì)重塑復合物中的組分;可能不適合于研究對象之間年齡差異大的情況 |
|
α-Tubulin |
55 |
可能不適合于研究對象之間年齡差異大的情況，微管蛋白的表達隨著抗菌和抗有絲分裂抗性藥物而改變，因此在加入抗癌和抗真菌藥物時 |
|
|
β-Tubulin |
55 |
||
|
GAPDH |
36 |
組織細胞缺氧會引起GAPDH表達上調(diào)，因此不適用于與氧有關的研究，糖尿病等因素會導致 GAPDH的表達量增高 |
|
|
Vinculin |
117 |
大分子量蛋白可參考 |
|
|
線粒體 |
COXIV 系列 |
15-17 |
該系列蛋白主要集中于15-17KDa,如果目標蛋白分子量接近，可考慮其他內(nèi)參 |
|
HSP60 |
60 |
||
|
細胞核 |
VDAC1/2 |
31-37 |
該系列蛋白主要集中于31-37KDa |
|
Lamin B1 |
66 |
不是適用于胚胎干細胞，凋亡實驗中不適合做內(nèi)參 |
|
|
PCNA |
36 |
非增值細胞不適用 |
|
|
TBP |
33-43 |
TBP在人類中是37-43KDa,在小鼠和大鼠中是33-36KDa，不適合凋亡實驗 |
|
|
YY1 |
65-70 |
||
|
Histone H3 |
17 |
多數(shù)蛋白分子量在17KDa左右，如果目標蛋白分子量接近，可考慮其他內(nèi)參 |
|
|
全血、血清、血漿 |
Transferrin |
77 |
表達狀況受某些疾病狀態(tài)和治療的影響，比如視黃酸 |
|
Albumin |
66 |
含量極高，注意降低WB實驗上樣 |
標簽抗體搭配使用效果更佳
在研究蛋白相關相互作用等實驗中比如pull down, 通過分子生物學手段，表位標簽可融合至目的蛋白的 N或C 末端，常用的表位標簽有 His、HA、Myc和GST 等。這些表位標簽通常不會影響目的蛋白的生物活性和細胞內(nèi)定位。表位標簽的出現(xiàn)，為科學研究和工業(yè)生產(chǎn)提供了方便。
|
表位標簽 |
標簽序列 |
分子量 |
|
HA 標簽 |
YPYDVPDYA |
1.1 KD |
|
Myc 標簽 |
EQKLISEEDL |
1.2 KD |
|
DYKDDDDK |
DYKDDDDK |
1 KD |
|
GST Tag |
- |
26 KD |
|
GFP Tag |
- |
26.9 KD |
|
V5 標簽 |
GKPIPNPLLGLDST |
1.4 KD |
|
S-tag |
KETAAAKFERQHMDS |
1.8 KD |
|
E-tag |
GAPVPYPDPLEPR |
1.4 KD |
|
類型 |
產(chǎn)品名稱 |
分子量 |
產(chǎn)品編號 |
|
內(nèi)參抗體 |
42 kDa |
30101ES |
|
|
42 kDa |
30102ES |
||
|
36 kDa |
30201ES |
||
|
36 kDa |
30202ES |
||
|
50-55 kDa |
30304ES |
||
|
50-55 kDa |
30301ES |
||
|
50-55 kDa |
30302ES |
|
類型 |
產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
|
標簽抗體 |
30402ES |
|
|
30403ES |
||
|
30404ES |
||
|
30405ES |
||
|
30501ES |
||
|
30502ES |
||
|
30505ES |
||
|
30601ES |
||
|
30602ES |
||
|
30702ES |
||
|
30703ES |
||
|
30704ES |
||
|
30801ES |
||
|
30901ES |
||
|
30902ES |
||
|
30903ES |
||
|
31001ES |
||
|
31002ES |
||
|
31003ES |
||
|
31101ES |
||
|
31201ES |
||
|
31211ES |
|
類型 |
名稱 |
貨號 |
|
親和純化凝膠 |
20585ES |
|
|
20586ES |
||
|
20587ES |
||
|
20588ES |
||
|
20589ES |
文獻引用：
[1]Zheng G, Jiang C, Li Y, et al. TMEM43-S358L mutation enhances NF-κB-TGFβ signal cascade in arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy[J]. Protein & cell, 2018: 1-16.
IF（6.228）
[2] Wang T, Wang J, Wang J, et al. HAP1 is an in vivo UBE3A target that augments autophagy in a mouse model of Angelman syndrome[J]. Neurobiology of disease, 2019, 132: 104585. 30101 IF 5.36
[3] Peng RR, Wang LL, Gao WY, et al. The 5.8S pre-rRNA maturation factor, M-phase phosphoprotein 6, is a female fertility factor required for oocyte quality and meiosis. Cell Prolif. 2020;53(3):e12769.
GAPDH IF: 5.753
[4] Tan K S, Zhang Y, Liu L, et al. Molecular cloning and characterization of an atypical butyrylcholinesterase-like protein in zebrafish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2021: 110590. Flag-Tag (DYKDDDDK), mouse 30503ES20
[5] Zhuang W, Yan Z. The S2–S3 Loop of Kv7. 4 Channels Is Essential for Calmodulin Regulation of Channel Activation[J]. Frontiers in Physiology, 2020, 11. 30601ES20
[6] Wang Y, Hou Y, Qiu J, et al. Abscisic acid promotes jasmonic acid biosynthesis via a ‘SAPK10 ‐bZIP72‐AOC’pathway to synergistically inhibit seed germination in rice (Oryza sativa)[J]. The New Phytologist, 2020, 228(4): 1336. GST\HIS\GFP coip
[7] S Chen, et al. Novel Role for Tranilast in Regulating NLRP 3 Ubiquitination, Vascular Inflammation, and Atherosclerosis JAHA. June 16, 2020 Vol 9, Issue 12 αTUBULIN
[8] Wu L, Gao A, Lei Y, Li J, Mai K, Ye J. SHP1 tyrosine phosphatase gets involved in host defense against Streptococcus agalactiae infection and BCR signaling pathway in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Fish Shellfish Immunol. 2020;99:562-571. β-actin
[9] Wu F, Xu K, Xu K, et al. Dl-3n-butylphthalide improves traumatic brain injury recovery via inhibiting autophagy-induced blood-brain barrier disruption and cell apoptosis. J Cell Mol Med. 2020;24(2):1220-1232.GAPDH
[10] Liu X , Sun T , Ge Q , et al. Construction of Novel Bispecific Single-Domain Antibodies (BiSdAbs) with Potent Antiangiogenic Activities[J]. 2020. GAPDH rabbit antibody
