mRNA體外合成整體解決方案
隨著生物科技的發(fā)展，生物治療業(yè)已成為重要的前沿疾病治療技術(shù)，其中利用RNA體外合成技術(shù)制備的mRNA疫苗在2020年大爆發(fā)的COVID-19傳染病上產(chǎn)生了巨大的影響。很多公司如美國(guó)Moderna、德國(guó)CureVac、BioNTech等均已經(jīng)開(kāi)展了其他疾病如腫瘤、傳染病、慢性病等治療性mRNA疫苗和藥物開(kāi)發(fā)。
mRNA疫苗
mRNA（Messenger RNA或信使RNA）在人類生物學(xué)中起著基本作用，它轉(zhuǎn)移存儲(chǔ)在DNA中的指令來(lái)制活細(xì)胞所需的蛋白質(zhì)。mRNA疫苗是將RNA在體外進(jìn)行相關(guān)的修飾后傳遞至機(jī)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并產(chǎn)生蛋白抗原，從而導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答，進(jìn)而擴(kuò)大機(jī)體的免疫能力[2,3]。mRNA疫苗分為非復(fù)制性mRNA(nonreplicating mRNA)和自擴(kuò)增mRNA(self-amplifying mRNA)兩類：自擴(kuò)增mRNA不僅編碼目標(biāo)抗原，而且還編碼能夠使細(xì)胞內(nèi)RNA擴(kuò)增和蛋白表達(dá)的復(fù)制機(jī)制。非復(fù)制性mRNA疫苗僅編碼目標(biāo)抗原并包含5′和3′非翻譯區(qū)（UTR），它們提供對(duì)適應(yīng)性和先天免疫力的綜合刺激，即原位抗原表達(dá)和危險(xiǎn)信號(hào)傳遞。
mRNA疫苗開(kāi)發(fā)流程包括病原體識(shí)別、測(cè)序、mRNA體外合成和修飾、純化等操作。
圖1. mRNA疫苗的示意圖及其抗原表達(dá)的機(jī)制[4]
圖2. mRNA疫苗生產(chǎn)制備流程圖[5]
在mRNA疫苗和基因治療等領(lǐng)域中，高效合成高質(zhì)量的mRNA是實(shí)現(xiàn)療法目標(biāo)的關(guān)鍵步驟。而在這一過(guò)程中，T7 RNA聚合酶扮演著至關(guān)重要的角色，它能夠高效地催化體外合成mRNA的過(guò)程。
盡管T7 RNA聚合酶在mRNA合成中發(fā)揮著重要作用，但實(shí)際操作中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生雙鏈RNA（dsRNA）這一副產(chǎn)物。dsRNA的存在不僅降低了mRNA的產(chǎn)量和純度，還可能激發(fā)非特異性免疫反應(yīng)，影響療效和安全性。因此，減少dsRNA的產(chǎn)生成為了行業(yè)的一個(gè)迫切需求。
翌圣生物利用其ZymeEditor定向進(jìn)化平臺(tái)的能力，持續(xù)在進(jìn)化mRNA體外合成的核心酶原料—T7 RNA聚合酶，開(kāi)發(fā)出一款低dsRNA T7 RNA 聚合酶，可大幅度降低dsRNA，
» 產(chǎn)品特點(diǎn)
- 產(chǎn)量：均穩(wěn)定在9mg/mL
- dsRNA含量：野生型T7 RNAP的dsRNA的含量顯著降低了10倍以上
- 片段加帽率高：均超過(guò)99%
»產(chǎn)品數(shù)據(jù)
- 在不同長(zhǎng)度的應(yīng)用場(chǎng)景下，dsRNA無(wú)論跟WT T7 ，還是競(jìng)品，在保證其他指標(biāo)不降的前提下，dsRNA 均有大幅度下降。
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片段長(zhǎng)度 |
T7 RNA pol |
產(chǎn)量（mg/mL） |
完整度（%） |
dsRNA含量（(1ug RNA產(chǎn)生 ng的dsRNA) |
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4K |
T7-WT |
12.4 |
88.3 |
0.4273 |
|
T7-低dsRNA |
12.1 |
89.9 |
0.0129 |
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競(jìng)品 |
11.0 |
87.8 |
0.0323 |
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9K |
T7-WT |
9.5 |
81.9 |
2.9180 |
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T7-低dsRNA |
9.0 |
82.0 |
0.0379 |
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|
競(jìng)品 |
7.2 |
78.7 |
0.1805 |
2、降低Cap analog的投入量，在不同的片段長(zhǎng)度，以及與WT的對(duì)比下，投入量降低到2.5mM， 仍能得到優(yōu)異的加帽率。同時(shí)在細(xì)胞層面上，也能得到優(yōu)異的表現(xiàn)。
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Cap analog投入量（mM） |
加帽率（%）-4K |
1K |
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WT |
mutant |
WT |
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10 |
100 |
100 |
100 |
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5 |
100 |
100 |
100 |
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2.5 |
100 |
100 |
99.7 |
» 相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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10628ES10/60/72 |
10KU/100KU/250KU |
mRNA體外合成
體外合成RNA（IVT）主要是以DNA為模板通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到，常用的是以線性化質(zhì)粒DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板利用RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成。主要過(guò)程是利用含有T7啟動(dòng)子（TAATACGACTCACTATAGGG）或SP6啟動(dòng)子（ATTTAGGTGACACTATAG）序列的DNA為模板在含有T7或SP6 RNA聚合酶的條件下，以NTP為底物合成與模板DNA中一條鏈互補(bǔ)的mRNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的mRNA分子，通過(guò)在5’端加上帽子結(jié)構(gòu)和3’端加ployA尾加強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。
圖3. 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA生產(chǎn)和裝配過(guò)程[6]
翌圣生物經(jīng)過(guò)匠心研發(fā)開(kāi)發(fā)出的Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit高產(chǎn)量體外合成試劑盒包含一整套的RNA合成所需試劑，并配有詳細(xì)的教程。試劑盒可以合成長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本以及短轉(zhuǎn)錄本，以1μg的模板投入量可以產(chǎn)生100-200 μg的RNA，適用于單鏈 RNA合成（包括siRNA等各類RNA前體及RNA探針）和以Cap analog為引物合成Capped mRNA。
» 產(chǎn)品特點(diǎn)
高產(chǎn)量：2h內(nèi)產(chǎn)生100-200µg，單次放大反應(yīng)可產(chǎn)生毫克級(jí)RNA
多功能: 適用于長(zhǎng)片段和短片段RNA轉(zhuǎn)錄
靈活性: 可獲得無(wú)標(biāo)記、標(biāo)記以及加帽的RNA
» 測(cè)試數(shù)據(jù)
圖4. 不同長(zhǎng)度轉(zhuǎn)錄-時(shí)間梯度電泳圖
圖5. 不同目的片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量
圖6. 不同目的片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物品質(zhì)
» 相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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10623ES50/60 |
50/100T |
mRNA修飾
由于RNA的穩(wěn)定性較弱，因此合成后的mRNA穩(wěn)定性是必須要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。通常需要通過(guò)在5’端加上帽子結(jié)構(gòu)和3’端加ployA尾加強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。翌圣提供低殘留和高效加帽的Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）是經(jīng)過(guò)GMP生產(chǎn)獲得，完全滿足疫苗生產(chǎn)所需，并提供其他相關(guān)的酶類和試劑。
» 產(chǎn)品特點(diǎn)
生產(chǎn)工藝：GMP工藝生產(chǎn)
殘留：無(wú)核酸酶、內(nèi)毒素含量低
來(lái)源：大腸桿菌重組表達(dá)
純度高：純度 >95%（SDS-PAGE）
比活：~160000U/mg(BCA)
» GMP級(jí)別質(zhì)檢
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質(zhì)檢項(xiàng)目 |
蛋白酶 |
核酸外切酶 |
切口酶 |
RNA酶 |
內(nèi)毒素 |
宿主蛋白 |
宿主核酸 |
無(wú)菌檢測(cè) |
病原體 |
支原體 |
… |
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√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
注：具體質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)參考具體COA，病原體包括HBC/HCV/HIV，其他產(chǎn)品病原體檢測(cè)均是。
» 加帽效率
質(zhì)譜測(cè)定兩種酶的加帽效率，并與對(duì)照品的酶加帽效率進(jìn)行對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)翌圣的加帽效率比較高，獲得的產(chǎn)物的純度也較高。
» 殘留檢測(cè)
分別檢測(cè)Rnase、核酸酶、切口酶、大腸桿菌DNA殘留，經(jīng)檢測(cè)結(jié)果顯示，成品無(wú)相關(guān)酶的殘留，且表達(dá)的宿主DNA殘留也達(dá)到了要求標(biāo)準(zhǔn)。
» 相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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10614ES84/92/94 |
2000/10000/20000U |
mRNA殘留去除
合成后的產(chǎn)物可能會(huì)有DNA殘留，在疫苗開(kāi)發(fā)階段，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟，以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。翌圣生物開(kāi)發(fā)的DNase I是通過(guò)原核生物表達(dá)并經(jīng)過(guò)GMP工藝生產(chǎn)，滿足疫苗開(kāi)發(fā)的需求。
» 產(chǎn)品特點(diǎn)
生產(chǎn)工藝：GMP工藝生產(chǎn)
殘留：無(wú)核酸酶、內(nèi)毒素含量低
來(lái)源：大腸桿菌重組表達(dá)
純度高：≥80% by Biuret
酶活：≥2000 Kunitz Units/mg protein
» GMP級(jí)別質(zhì)檢
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質(zhì)檢項(xiàng)目 |
蛋白酶 |
核酸外切酶 |
切口酶 |
RNA酶 |
內(nèi)毒素 |
宿主蛋白 |
宿主核酸 |
無(wú)菌檢測(cè) |
病原體 |
支原體 |
… |
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√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
√ |
注：具體質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)參考具體COA
» 測(cè)試數(shù)據(jù)
圖7. RNAse殘留檢測(cè)
通過(guò)SDS-PAGE分析確定的DNase I（無(wú)RNase）純度約為95%。
圖8. DNase I（無(wú)RNase）純度檢測(cè)（SDS-PAGE）
» 相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
|
10611ES76/84 |
500/2000U |
mRNA純化
在經(jīng)歷嚴(yán)格的合成及修飾后，所獲得的mRNA需要進(jìn)一步的純化以達(dá)到后續(xù)研究的純度標(biāo)準(zhǔn)。翌圣生物開(kāi)發(fā)的mRNA純化磁珠是偶聯(lián)了Oligo（dT）的微米級(jí)順磁性微球。運(yùn)用Oligo(dT)特異結(jié)合到mRNA上Poly(A)尾端，特異地將mRNA從總RNA中分離出來(lái)。
» 產(chǎn)品特點(diǎn)
高效率：mRNA純化在45min內(nèi)完成
高純度：Oligo(dT) 磁珠特異性吸附mRNA
靈活：兼容手動(dòng)和自動(dòng)化操作平臺(tái)
可靠：獲得的mRNA適用NGS、體外翻譯、RT-PCR和CDNA合成
» 純化效果好
使用磁珠純化擬南芥和小鼠肝組織RNA樣本，Hieff NGS® mRNA Isoaltion Beads的mRNA回收效率更高，rRNA的去除效果更好。
圖9. mRNA Isolation Kit純化不同RNA樣本中的mRNA 管家基因產(chǎn)量表征mRNA回收效果。rRNA相關(guān)基因產(chǎn)量表征rRNA去除效果
圖10. mRNA 純化操作流程
» 相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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12603ES24 /96 |
24/96T |
翌圣生物作為分子酶領(lǐng)域創(chuàng)新領(lǐng)導(dǎo)者，專注為您提供高品質(zhì)的分子酶產(chǎn)品及相關(guān)試劑盒，為您的科學(xué)研究和藥物及疫苗的開(kāi)發(fā)提供更多選擇和方便，也為人類的未來(lái)健康事業(yè)奉獻(xiàn)一份力量。
其他相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
|
10625ES10/60/86 |
10/100/2500KU |
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10628ES10/60/72 |
10/100/250KU |
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10621ES10/20/60 |
10/20/100KU |
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10620ES10/60/80 |
10/100U/1000U |
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10623ES50/60/70 |
50/100/500T |
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10614ES84/92/96 |
2/10/100KU |
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10612ES92/97/98 |
10000/50000/250000U |
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10619ES02/25/50 |
0.5/25/50mL |
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10611ES76/84/92 |
500/2000/10000U |
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10655ES03/10/60 |
1/10/100mL |
【1】Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.
【2】苗鶴凡, 郭勇, 江新香. mRNA疫苗研究進(jìn)展及挑戰(zhàn)[J]. 免疫學(xué)雜志, 2016(05):446-449.
【3】Kramps T., Elbers K. (2017) Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines. Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY.
【4】Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.
【5】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,
【6】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,
HB201226
