T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)，生物界的“502”
T4 DNA連接酶（T4Lig）在分子克隆和高通量測序文庫構建中有著不可或缺的作用，目前市場上存在有多種類型的該產(chǎn)品，追本溯源這些產(chǎn)品對應的本質(zhì)相同，那么對應本質(zhì)到底是什么呢？
背景須知
DNA連接酶是一種能夠催化相鄰DNA的3’-OH和5’-磷酸基末段形成磷酸二酯鍵，并且把兩段DNA拼接起來的核酸酶。T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase，T4Lig）是目前應用比較多的病毒基因組編碼的DNA連接酶，主要從缺失型嗜菌體中提取，噬菌體T4的30基因是該酶的合成基因。
圖1.DNA連接酶模擬結構圖
結構了解
數(shù)據(jù)庫中（UniProtKB登錄號：P00970）顯示出DNA連接酶有三個保守性結構域：DNA 結合結構域DBD（DNA-binding domain，M1~ L129），腺苷酰化結構域AdD（adenylaition domain，I130~E368），寡核苷酸鏈結合結構域OB（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。
圖2、T4lig 模擬結構，R164、R182、R359、K365 是ATP 結合位點，E217、E344 二價金屬離子結合位點
作用機制
A 連接反應機理是基于切口雙鏈DNA 底物得到的。連接反應由三步完成：
①T4 DNA ligase先由ATP供能產(chǎn)生E-AMP復合物；
②E-AMP復合物識別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉(zhuǎn)移到5’-P基團，形成5’-P -AMP 復合物；
③3’-OH 親核攻擊5’-P-AMP 形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP.
圖3、T4 DNA連接酶作用原理圖
利用目前已知的T4Lig的連接特點，在具體的基因工程操作中，科研人員對DNA片段的連接方法分為以下三種：
（1）連接dsDNA的粘性末端：用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，形成具有黏性末端的DNA 片段，利用DNA 連接酶直接連接；
應用：載體構建，大分子條帶的連接
（2）連接平末端：對于平末端的DNA 片段的連接常利用T4 DNA 連接酶連接
應用：高保真擴增后的平末端條帶的連接、平末端載體構建
（3）連接人為合成粘性末端：在DNA 片段末端加上poly（dA）-poly（dT）尾，或化學合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端之后，再用DNA 連接酶將它們連接起來
應用：NGS文庫構建中接頭的連接
這三種方法的原理基本一樣，都是利用DNA 連接酶形成磷酸二酯鍵來封閉DNA 片段之間的間隙。
整理小結
T4lig最早從T4嗜菌體感染的E. coli 提取. 后來發(fā)現(xiàn)DNA復制缺失型嗜菌體中連接酶產(chǎn)量更高，作為連接酶的主要來源。人們發(fā)現(xiàn)T4的合成基因，了解作用機理，并逐步推廣應用，目前市場供應連接酶主要通過基因工程方法生產(chǎn)，不同公司在此基礎上經(jīng)過不同基因位點的改造和篩選，使之對應的T4 DNA酶效不斷提高。
翌圣生物成立于2014年，專注于分子酶的生產(chǎn)和改造，是一家擁有多重酶改造技術的高新技術企業(yè)；不僅生產(chǎn)高質(zhì)量的普通T4 DNA ligase，同時利用定向改造技術，將T4 DNA ligase的有效催化活性結構域通過多輪突變篩選，得到一種連接活性更強的突變型T4 DNA ligase。
普通T4 DNA ligase可滿足日常的大部分實驗，具體極高的性價比。Fast T4 DNA ligase具有高效的連接能力，非常適合復雜結構核酸片段的連接，如進行FFPE和cfDNA文庫的構建、華大測序平臺接頭的連接等。
訂購信息
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產(chǎn)品名稱 |
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10300ES80/97 |
1000/ 50000U |
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10301ES40 |
40000U |
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40000U |
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參考文獻：
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