遺傳霉素的作用原理
遺傳霉素（Geneticin，G418）是一種氨基糖苷類抗生素，它通過與原核和真核細(xì)胞的70S和80S核糖體結(jié)合，阻斷肽鏈延伸，從而抑制蛋白質(zhì)合成。這一機制對包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞等都有毒性。當(dāng)細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染并整合含有新霉素抗性基因（如neo基因）后，該基因編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH(3)II）能夠共價修飾G418，使其失活，從而賦予細(xì)胞在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長的抗性。
在分子遺傳試驗中，G418是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑之一。
遺傳霉素的應(yīng)用
G418通過抑制蛋白合成，用于篩選含有抗性基因（如neo基因）的細(xì)胞?？剐曰蚓幋a的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，從而賦予細(xì)胞對G418的抗性。通常情況，哺乳動物細(xì)胞篩選范圍是200-2000 μg/mL，最常用的工作濃度為100-700 μg/mL。其中植物細(xì)胞是10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞是500-1000 μg/mL，以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。
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細(xì)胞 |
應(yīng)用 |
遺傳霉素激活濃度 (μg/mL) |
引用文獻(xiàn) |
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網(wǎng)柄菌屬 |
a）培養(yǎng)在培養(yǎng)液中 b）培養(yǎng)在凍干細(xì)菌上 |
a) 10 μg/mL |
Hirth,et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982). |
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哺乳動物 |
a）用于篩選 b）用于維持生長 |
a) 400 -1000 μg/mL |
Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982). |
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植物 |
a）用于篩選 b）用于維持生長 |
a) 25-50 μg/mL |
Ursic, et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981). |
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酵母 |
a）用于篩選 b）用于維持生長 |
a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL |
Jimenez and Davies, Nature, v. 287, 869-871 (1980). |
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細(xì)菌 |
用于篩選 |
16 μg/mL |
Waitz, et. al., Antimicrob. Agents Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974). |
在基因敲除中，G418可以用于篩選成功敲除目標(biāo)基因的細(xì)胞。在基因轉(zhuǎn)移中，G418有助于將外源基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組。
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，G418用于篩選能夠抵抗該抗生素的細(xì)胞，這些細(xì)胞通常攜帶有特定的抗性基因。
遺傳霉素的相關(guān)實驗步驟
1）活力單位的換算
根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應(yīng)的質(zhì)檢報告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為：750 U/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL。
如果配制10 mL的G418儲存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取666.7 mg粉末。
2）除菌和保存
根據(jù)上述換算得到的實際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其完全溶解。
先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。
1) 第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；
2) 根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度，至少選擇6個濃度（處理分裂期的細(xì)胞時G418的活性最強，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時間），以哺乳動物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3) 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基，每個濃度做三個平行孔。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
1）轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3）篩選7天后觀察并評估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染以及篩選效果。
4）挑取并轉(zhuǎn)移5-10個抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。
5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
產(chǎn)品推薦
翌圣生物提供的G418 遺傳霉素（60220ES）效力≥720 U/mg，純度~98%，且批次穩(wěn)定，與其他公司的G418產(chǎn)品相比，價格近1/3。
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規(guī)格 |
S*品牌 |
T*品牌 |
翌圣生物 |
翌圣優(yōu)勢 |
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純度 (HPLC) |
/ |
/ |
~98% |
純度高 |
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效力 (U/mg) |
≥720 |
707-721 |
≥720 |
效力較高 |
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價格(元/5 g) |
3762 |
3325 |
1408 |
價格便宜 |
以大腸桿菌為實驗對象，G69和G99是兩個不同的批次；基因組霉素的使用濃度分別為8 mg/L、12 mg/L和16 mg/L，有效最小濃度為16 mg/L，完全抑制了雜菌的生長。
圖1.不同批次間基因組霉素有效濃度的穩(wěn)定性試驗和驗證
注意事項
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G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會產(chǎn)生交叉活性。
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配制G418溶液時，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
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G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細(xì)胞密度過高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
-
即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
規(guī)格 |
價格（元） |
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60210ES25/60 |
25 /100 mg |
678/2028 |
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60216ES60/80 |
100/10×100 mg |
453/3353 |
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60217ES20/60 |
20/5×20 mg |
868/3268 |
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60218ES10/50/60/80 |
10/5×10/10×10 mg/1 g |
688/2446/4483/22595 |
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60220ES03/08 |
1/5 g |
358/1480 |
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60224ES03 |
1 g (20 ml) |
849 |
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60225ES03/10 |
1/10 g |
719 /6599 |
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60231ES03/08 |
1/5×1 mg |
1366/4266 |
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
規(guī)格 |
價格（元） |
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Penicillin-Streptomycin (100×), Suitable for Cell Culture 細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素（雙抗） |
60162ES76 |
100 mL |
158 |
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60201ES25/60 |
25/100 g |
198/588 |
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60202ES08/25 |
5/25 g |
358/1428 |
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60203ES10/60 |
10/100 g |
108/968 |
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60204ES03/08 |
1/5 g |
106/445 |
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60205ES08/25 |
5/25 g |
48/208 |
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60206ES10/60 |
10/100 g |
169/1436 |
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60207ES25/60 |
25/100 g |
148/488 |
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60208ES25/60 |
25/100 g |
289/1049 |
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60211ES25/60 |
25/100 g |
119/339 |
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60212ES25/60 |
25/100 g |
168/678 |
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60213ES60/80 |
100 mg/1 g |
287/677 |
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60214ES03/08 |
1/5 g |
349/1150 |
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60215ES08 |
5 g |
479 |
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60226ES03/08 |
1/5 g |
102/325 |
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60234ES03/08 |
1/5 g |
159/579 |
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60238ES01/03 |
100 mg/1 g |
479/3349 |
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