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產品描述
本產品是探針法2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。采用的抗體法熱啟動Unicon® DNA聚合酶（貨號：10113ES）可以有效抑制引物非特異性退火導致的擴增。同時，配方優(yōu)化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，適合低濃度模板的擴增，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內獲得良好的標準曲線。
產品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產品編號/規(guī)格 |
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11205ES03（1 mL） |
11205ES08（5 mL） |
11205ES25（25 mL） |
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11205-A |
2×Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix |
1 mL |
1 mL × 5 |
25 mL |
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11205-B |
50×Low Rox |
40 μL |
200 μL |
1 mL |
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11205-C |
50×High Rox |
40 μL |
200 μL |
1 mL |
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。本品避免反復凍融。建議分裝保存。
反應體系
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組分 |
體積（μL） |
體積（μL） |
終濃度 |
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2×Hieff Unicon® qPCR TaqMan Probe Master Mix |
10 |
25 |
1× |
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Forward Primer (10 μM) |
0.4 |
1 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM) |
0.4 |
1 |
0.2 μM |
|
TaqMan Probe (10 μM) |
0.2 |
0.5 |
0.1 μM |
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50×High or Low Rox |
0.4 |
1 |
1× |
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模板DNA |
X |
X |
- |
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無菌超純水 |
to 20 |
to 50 |
- |
【注】： 使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 參比染料：Rox的添加，可根據不同儀器型號進行選擇，具體可參考【適用機型】。
b) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
c) 探針濃度：探針終濃度在50 nM-250 nM之間。
d) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
e) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好。
f) 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
g) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
擴增程序 （兩步法程序）
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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預變性 |
95℃ |
1 min |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
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退火、延伸 |
60℃ |
30 sec |
40 |
【注】
a) 預變性時間：根據不同模板和引物的具體情況可適當增加預變性時間至3 - 5 min。
b) 退火溫度和時間：建議在56-64℃范圍內調整。如果反應效果不好，可以適當延長反應時間。
c) 熒光信號采集：請參考儀器設置。
結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。
反應結束后需要確認擴增曲線。進行PCR定量時，需要制作標準曲線。
反應特異性需要瓊脂糖凝膠電泳確認。
引物設計指南
1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp內選擇。
2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4）引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補序列。
5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
TaqMan 探針設計指南
1）探針長度一般為18-40 bp。探針序列應盡量接近正向或者反向引物，但不能與之有重合區(qū)域。
2）探針的退火溫度應為 65-67℃。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基。探針5’端應避免使用堿基G。
4）若序列中包含多態(tài)性位點，應使其位于探針序列中間。
適用機型
High Rox適用機型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™;
Low Rox 適用機型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™6,7,12k Flex;
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;
不需要Rox校正的儀器型號：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™;
Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000;
Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96;
Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR.
相關產品
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產品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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11208ES08 |
5 mL |
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11211ES03 |
1 mL |
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Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix (UDG plus) |
11212ES03 |
1 mL |
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31301ES60 |
100 µg |
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|
10303ES60 |
100 U |
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|
10128ES72 |
250 μL |
HB210604
