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          Calcein-AM/PI Double Stain Kit Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒
           
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          產(chǎn)品說明書
                  
          FAQ
                  
          COA
                  
          已發(fā)表文獻
                  
           
          產(chǎn)品描述
          


          Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。
          


          由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯(lián)合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。
          


          本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標(biāo)記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系，單次就200 µL細胞懸液進行染色，分別可以做500次（CAS: 40747ES76）和1000次（CAS: 40747ES80）檢測。
          



          
產(chǎn)品組分
          


          
	
		
          
			
			
          編號
          
			          		
			
			
          組分
          
			          		
			
			
          產(chǎn)品編號/規(guī)格
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          40747ES76
          

			
          (500T)
          
			          		
			
			
          40747ES80
          

			
          (1000T)
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          40747-A
          
			          		
			
			
          Calcein-AM Solution (2 mM)
          
			          		
			
			
          50μL
          
			          		
			
			
          50μL×2
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          40747-B
          
			          		
			
			
          PI Solution（1.5 mM）
          
			          		
			
			
          150μL
          
			          		
			
			
          150μL×2
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          40747-C
          
			          		
			
			
          10×Assay Buffer
          
			          		
			
			
          50mL
          
			          		
			
			
          100mL
          
			          		
		
          
	          

          



          

          
運輸和保存方法
          


          冰袋運輸；其中A組分和B組分需-20℃避光干燥保存，C組分-20℃保存，經(jīng)常使用可放在4℃保存。一年有效。
          



          
使用方法
          


          1. 工作液的配制
          


          1.1 1×Assay Buffer（反應(yīng)緩沖液）的配制
          


          從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。
          


          1.2 1×染色工作液的配制
          


          1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30 min。
          
注          意：第一次使用可對母液進行分裝，以減少反復(fù)凍融次數(shù)。 
          


          2）取5 µL Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µL PI溶液（1.5 mM）加入5 mL 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2 μM，PI的工作液濃度為4.5 μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果。
          
注意：由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。
          


          2. 染色步驟
          


          2.1  對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之后離心收集細胞（1000 rpm，3 min）。
          


          對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3 min）收集細胞。 
          


          2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。
          


          2.3  用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為1×105~1×106細胞/mL。
          


          2.4  取100 µL染色工作液加入200 µL細胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15 min。
          
注意：如果需要，可延長孵育時間至30min。
          


          2.5  熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545 nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進行檢測。
          
注意：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。
          


          a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細胞10 min，或者用70%乙醇孵育細胞30 min，從而制備死細胞；
          


          b）用0.1-10 µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。
          


          c）用0.1-10 µM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到不會對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。
          



          
注意事項
          


          1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
          


          2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。
          


          3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
          


          4）本產(chǎn)品僅作科研用途！
          



          
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          40711ES60
          
			          		
			
			
          100 mg
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          40710ES03
          
			          		
			
			
          碘化丙啶染液（1mg/ml）
          
			          		
			
			
          1mL
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          60386ES08
          
			          		
			
			
          Saponin from Quillaja Bark 皂素，來源于皂樹皮
          
			          		
			
			
          5G
          
			          		
		
          
		
          
			
			
          60386ES25
          
			          		
			
			
          25G
          
			          		
		
          
	          

          


          HB190610
          

             
           
           
           
           
           
           
           
          400-6111-883