產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix是2×實時定量PCR擴增的預混液，具有高靈敏度和高特異性的特點，同時，定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關系。核心組分Hieff® miRNA Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，再配以優(yōu)化的Buffer，可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增。另外，預混液體系中添加了ROX Reference Dye，能夠適用于不同qPCR儀器，配置反應體系時只需加入引物和模板即可進行擴增。
運輸和保存方法
冰袋運輸。-20℃可避光保存，有效期18個月。
本品避免反復凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料 SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
注意事項
1）推薦與本公司Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat#11139ES) 配套使用。
2）Master Mix組分在使用前都應充分震蕩混勻，低速離心。
3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
4）本產(chǎn)品僅作科研用途！
反應體系
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組分 |
體積（μL） |
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Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
10 |
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Forward Primer (10 μM) |
0.5 |
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Reverse Primer (10 μM) |
0.5 |
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模板cDNA |
x |
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ddH2O |
to 20 |
【注】：使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
a）引物濃度：通常引物終濃度為0.25 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進行調(diào)整。
b）模板濃度：如模板為未稀釋 cDNA 原液，使用體積不應超過 qPCR 反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的Ct值在20-30個循環(huán)為好。
d) 反應體系：推薦使用20 μL體系反應，以確保目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
反應程序
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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預變性 |
95℃ |
5 min |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
30 sec* |
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熔解曲線階段 |
儀器默認設置 |
1 |
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【注】：a）退火溫度和時間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整
b）熒光信號的采集（*）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：
20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec：Applied Biosystems 7300
32 sec：Applied Biosystems 7500
30 sec：BIO-Rad CFX 96
c）熔解曲線：儀器類型不同，熔解曲線采集程序不同，使用程序默認的熔解程序即可
結果分析
定量檢測至少需要三個生物學重復，反應結束后需要確認擴增曲線的線形及平滑度，熔解曲線的峰形。
1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值落在20-32之間時，定量分析比較準確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
若熔解曲線出現(xiàn)雙峰的情況，可以通過DNA瓊脂糖凝膠電泳進一步判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設計更高特異性的引物。
相關產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
100 T |
|
19331ES50 |
50 T |
|
|
19332ES50 |
50 T |
|
|
19221ES50 |
50 T |
|
|
11184ES08 |
5 mL |
HB211216
