產品簡介

 

支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)對各種生物材料（如細胞培養(yǎng)物、實驗動物分泌物和動物血清等）支原體感染的檢測。該試劑盒采用定量PCR技術，針對支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域設計兩套引物，進行兩輪PCR擴增，以第二輪擴增產物為準進行支原體污染情況判斷。其可檢出包括口腔支原體(M.orale)、肺炎支原體(M.pneumoniae)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨酸支原體(M.arginini)、雞敗血支原體(M.gallisepticum)、關節(jié)液支原體(M.synoviae)、發(fā)酵支原體(M.fermentans)、檸檬螺原體(Spiroplasma citri)、唾液支原體(M.salivarium)等在內的共34種支原體，靈敏度可達2.5 copies/uL，對于10 CFU/mL支原體標準菌株也可正常擴增有條帶，具備特異性強、靈敏度高、操作方便快速等特點，可直接用于細胞培養(yǎng)上清液的檢測。

本產品相較于常規(guī)PCR法支原體檢測試劑盒，可避免由于引物與模板之間的非特異配對，導致非特異性產物的產生；還可靈敏的檢測到樣本中微量的支原體DNA，避免假陰性的產生。

 

產品信息

 

貨號	40614ES10 / 40614ES20
規(guī)格	10 assays / 20 assays

 

組分信息

 

組分編號	組分名稱	40614ES10	40614ES20
40614-A*	GMyc-1st PCR Mix	460 μL	460 μL×2管
40614-B*	GMyc-2nd PCR Mix	490 μL	490 μL×2管
40614-C**	Positive Control Template	20 μL	40 μL

^*PCR反應極其靈敏，為防止假陽性，加樣時，最后加陽性對照。

^**40614-C：Positive Control Template，陽性對照。

 

運輸和儲存條件

 

干冰運輸，-25~-15℃保存，有效期1年。

^*整個試劑盒若較長時間不用，請避光保存。其中40614-C長期不用時，可-85~-65℃冷凍保存。

 

使用說明

 

1. 實驗前準備

1）提前準備實驗所需試劑耗材：

如：瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液、DNA marker等試劑和移液槍、無菌吸頭、離心管等耗材。

2）自備實驗所需設備和儀器：

如：漩渦振蕩器、PCR儀、微量離心機、電泳儀等。

2. 實驗方法

1）待測樣本類型：

a. 本試劑盒可以直接檢測細胞上清、血清和培養(yǎng)基，以及細胞DNA等。細胞培養(yǎng)3-6天后，直接取其上清液進行PCR反應。為排除細胞培養(yǎng)基抑制PCR反應，陽性對照中需加入等量的細胞上清液。

b. 對于細胞懸液類樣本，則需要先經過樣本前處理，提取總DNA后，才可進行檢測。

2）實驗結果判讀：

本試劑盒需要進行兩輪PCR反應：第一輪PCR結束后，取其反應產物作為第二輪PCR的模板，根據兩輪PCR產物電泳條帶之有無及片段大小來分析結果（第一輪陽性對照PCR條帶大小為389bp、第二輪陽性對照PCR條帶大小為247bp）。其中，應以第二輪擴增產物結果為準，進行有無支原體污染的判斷。

3）第一輪PCR：

a. 充分融解GMyc-1st PCR Mix（40614-A），按下列表格配制反應液：

試劑	陰性對照	實驗組	陽性對照
GMyc-1st PCR Mix（40614-A）	46 µL	46 µL	46 µL
待測樣本	/	4 µL	4 µL
Positive Control Template（40614-C）*	/	/	1 µL

表1 第一輪PCR反應體系

^*為防止40614-C污染，請先將陰性對照組和實驗組加樣完成后，再將40614-C加入陽性對照組。

b. 按下述條件進行PCR反應：

 

普通程序

94℃         5 min

94℃         30 sec

62℃         30 sec   30 cycles

72℃         30 sec

72℃         7 min

快速程序^*

95℃         5 min

95℃         15 sec

60℃         30 sec26 cycles

^*快速程序能夠縮短反應時間，但對于靈敏度會略有影響，可自行選擇使用普通程序或者快速程序。

4）第二輪PCR：

a. 充分融解GMyc-2nd PCR Mix（40614-B），按下列表格配制反應液：

試劑	陰性對照	實驗組	陽性對照
GMyc-2nd PCR Mix（40614-B）	49 µL	49 µL	49 µL
1st PCR反應液（10倍稀釋液）*	1 µL	1 µL	1 µL

表2 第二輪PCR反應體系

^*第一輪PCR反應液需經10倍稀釋后，方可作為第二輪PCR的模板。

b. 按下述條件進行PCR反應：

普通程序（總時長90min）

94℃         5 min

94℃         30 sec

62℃         30 sec   30 cycles

72℃         30 sec

72℃         7 min

快速程序^*（總時長48min）

95℃         5 min

95℃         15 sec

60℃         30 sec26 cycles

^*快速程序靈敏度為5copies/µL，普通程序靈敏度為2.5 copies/µL,可以根據需要切換程序，常規(guī)情況推薦普通程序，且不同程序的循環(huán)數不請嚴格按照說明書進行。

c. 反應結束后，取7~10 μL的PCR反應液^*（無需加Loading Buffer），直接進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產物^**。

^*以本輪（即第二輪）擴增產物為準進行支原體污染情況判斷。

^**根據PCR產物電泳條帶之有無及片段大小來分析結果（第二輪陽性對照PCR條帶大小為247bp）。

5）本試劑盒的推薦使用頻率：

檢測場景	推薦的檢測頻率
新細胞進入實驗室	必檢
液氮保存前	必檢
定期常規(guī)	每月檢測一次
發(fā)現污染后	每周檢測一次
發(fā)現細胞異常	隨時檢測

 

注意事項

 

1. 本產品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請仔細閱讀說明書，實驗應規(guī)范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

 

Ver.CN20241125