產(chǎn)品簡介   

質(zhì)粒DNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測疫苗、基因和細(xì)胞治療產(chǎn)品等生物制品中質(zhì)粒DNA殘留的試劑盒。因為這些生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)過程中通常會用到病毒載體（如慢病毒、腺病毒等），而病毒載體大多采用質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞基質(zhì)制備，所以為確保病毒載體純度和安全性，這些附在病毒載體表面的質(zhì)粒DNA在病毒純化環(huán)節(jié)會作為雜質(zhì)而去除。

本試劑盒針對市場所用質(zhì)粒共有DNA序列設(shè)計特異性引物，采用qPCR熒光探針原理，專一快速的檢測殘留的質(zhì)粒DNA，其最低檢測限可以達(dá)到1 copies/μL水平，試劑盒配套有線性Plasmid DNA Control（質(zhì)粒DNA定量參考品）。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

產(chǎn)品信息

貨號	41323ES50 / 41323ES60
規(guī)格	50 T / 100 T

 

組分信息

組分編號	組分名稱	41323ES50	41323ES60
41323-A	Plasmid qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41323-B	Plasmid Primer&Probe Mix	200 μL	400 μL
41323-C	DNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41323-D	Linear Plasmid DNA Control (4×108 copies/μL)	25 μL	50 μL
41323-E	IC*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，內(nèi)部對照

 

儲存條件

1. 所有組分均干冰運輸，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41323-A和41323-B均需避光保存。

2. 收到貨后，請檢查共5個組分是否齊全，并立即放入對應(yīng)的保存溫度中儲存。

 

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請仔細(xì)閱讀說明書，實驗應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

4. 每個組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

 

適用機型

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用說明

1. Plasmid DNA Control定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀釋液）將Linear Plasmid DNA Control定量參考品進(jìn)行梯度稀釋^*，稀釋濃度依次4×10⁷ copies/μL、4×10⁶ copies/μL、4×10⁵ copies/μL、4×10⁴ copies/μL、4×10³ copies/μL、4×10² copies/μL、4×10¹ copies/μL。

具體操作如下：

1）將試劑盒中的Plasmid DNA Control定量參考品和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2）取7支潔凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3）在標(biāo)記為Std0的1.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Plasmid DNA Control定量參考品，Std0即稀釋為4×10⁷ copies/μL的濃度，振蕩混勻后低速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過3個月）^**，使用時避免反復(fù)凍融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6離心管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer^***，再進(jìn)行梯度稀釋^****，具體稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	4×106 copies/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	4×105 copies/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	4×104 copies/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	4×103 copies/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	4×102 copies/μL
Std6	10 μL Std5 + 90 μL DNA Dilution Buffer	4×101 copies/μL

表1 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

^*每個濃度做3個復(fù)孔，該試劑可測試4×10⁶ copies/μL~4×10¹ copies/μL線性范圍。若需要，可適當(dāng)擴大或縮小線性范圍。

^**為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的DNA稀釋液可保存于2~8℃ 7天，若長時間不用，請放置于-25~-15℃。

^****為確保模板完全混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

2. 樣本加標(biāo)回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設(shè)置ERC中Plasmid DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加4×10⁵ copies Plasmid DNA量的ERC為例），具體操作如下：

1）取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std3，混勻，標(biāo)記為ERC。

2）加標(biāo)回收ERC和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收ERC純化液。

3. 陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實驗設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1）取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA稀釋液）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為NCS。

2）陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

4. 無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設(shè)置無模板對照NTC，具體操作如下：

1）無模板對照NTC無需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

2）每管或孔中NTC樣本為20 μL Mix混合液（即15 μL Plasmid qPCR Mix + 4 μL Plasmid Primer&Probe Mix + 1 μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個重復(fù)孔的量。

5. 反應(yīng)體系

組分	體積(μL)
Plasmid qPCR Mix*	15
Plasmid Primer&Probe Mix	4
IC	1
DNA Template**	10
總體積***	30

 

表2 標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

^*根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復(fù)孔。

^**反應(yīng)孔數(shù)=（6個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質(zhì)控NCS+待測樣TS個數(shù)+待測樣本對應(yīng)加標(biāo)回收ERC個數(shù)）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進(jìn)行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如10 μL的4×10⁴ copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品DNA后進(jìn)行樣本前處理，所得純化液為加標(biāo)回收ERC

^***加樣完成密封好管子后，請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下表為參考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待測樣本TS1

待測樣本TS1

待測樣本TS1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1

B

NTC

待測樣本TS2

待測樣本TS2

待測樣本TS2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std2

C

NTC

待測樣本TS3

待測樣本TS3

待測樣本TS3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std3

D

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std4

E

NCS

樣本加標(biāo)ERC1

樣本加標(biāo)ERC1

樣本加標(biāo)ERC1

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std5

F

NCS

樣本加標(biāo)ERC2

樣本加標(biāo)ERC2

樣本加標(biāo)ERC2

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std6

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std6

標(biāo)準(zhǔn)曲線Std6

G

NCS

樣本加標(biāo)ERC3

樣本加標(biāo)ERC3

樣本加標(biāo)ERC3

H

表3 上機參考板位

該示例是對Plasmid殘留DNA qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：6個濃度梯度的Plasmid DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質(zhì)控NCS、3個待測樣本TS、3個加樣回收ERC。建議每個樣本做3個重復(fù)孔。

6. 擴增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1）創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。

2）創(chuàng)建2個檢測探針，Target 1命名為“Plasmid-DNA”，選擇報告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“None”；Target 2命名為“IC”，選擇報告熒光基團(tuán)為“CY5”，猝滅熒光基團(tuán)為“None”。參比熒光為“ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號等情況，選擇是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“4000000”、“400000”、“40000”、“4000”、“400”、“40”（含義為每孔DNA濃度，單位為copies/μL），并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄命名為“4×10⁶ copies/μL”、“4×10⁵ copies/μL”、“4×10⁴ copies/μL”、“4×10³ copies/μL”、“4×10² copies/μL”、“4×10¹ copies/μL”；將無模板對照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標(biāo)回收ERC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”、“TS”、“ERC”，參比熒光勾選“ROX”，之后點擊“Start Run”，開始儀器運行。

4）擴增程序設(shè)置：設(shè)置三步法擴增程序，反應(yīng)體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	45
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

表4 擴增程序

7. qPCR結(jié)果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會自動給出“Threshold”，有時系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點擊“Analyze”。此時可在“Multicomponent Plot”初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²、擴增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的標(biāo)曲：R²＞0.99，擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標(biāo)回收ERC的檢測值，單位為copies/μL。

4）結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動判讀。

5）根據(jù)待測樣本TS和樣本加標(biāo)回收ERC的檢測結(jié)果計算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在50%～150%之間。加標(biāo)回收率計算公式：回收率(%) = {樣本加標(biāo)測定值(eg.copies/µL)-樣本測定值(eg.copies/µL)}×洗脫體積(eg.µL) / DNA加入量理論值(eg.copies)×100%。

6）陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)大于標(biāo)曲最低濃度Ct的均值。

7）無模板對照NTC的檢測結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。

8）待測樣本的Ct-IC值應(yīng)該與NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待測樣本的Ct-IC值與NTC的Ct-IC值相比明顯增大，則表明樣本可能存在明顯抑制。如果同時測試加標(biāo)樣本，則優(yōu)先考慮樣本加標(biāo)回收率結(jié)果，IC結(jié)果作為參考。

 

Ver.CN20230830