DNA-蛋白質(zhì)互作研究解決方案(上)
研究DNA與蛋白質(zhì)互作時，通常需要有目標DNA或者目標蛋白質(zhì)。如果研究時，只有處理材料，需要找尋處理材料中影響材料表型變化的調(diào)控因子，可以進行ATAC-seq實驗。
圖.100-10w細胞投入量ATAC結(jié)果
細胞投入量從100個到10萬個，均能得到建庫結(jié)果，且結(jié)果的擬合度較高。
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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Hieff NGS® ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina® ATAC建庫試劑盒 |
12208ES12/48 |
12 T/ 48 T |
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Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® Tn5測序接頭 |
48 T/ 192 T |
已知材料中研究蛋白質(zhì)，需要探究該目的蛋白質(zhì)靶向的DNA結(jié)合區(qū)域，可以使用ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq、CUT&RUN進行研究得到結(jié)合的DNA序列后，再利用EMSA、雙熒光素酶報告基因、酵母單雜交實驗、DNase I足跡試驗等。若是研究時，發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)共調(diào)控的區(qū)域，還需要進行CoIP或者GST pull down實驗進行驗證。
ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq、CUT&RUN介紹
ChIP
ChIP是研究DNA與蛋白互作的傳統(tǒng)經(jīng)典方法，需要將樣本進行甲醛交聯(lián)后再用超聲設(shè)備進行片段化處理，之后利用特異性抗體進行靶向富集，將富集得到的DNA進行建庫測序分析即得到靶向蛋白質(zhì)互作的DNA信息。
CUT&Tag是研究DNA與蛋白互作的新型技術(shù)，利用轉(zhuǎn)座酶對抗體靶向區(qū)域進行切割，將切割得到的DNA序列可以一步擴增得到DNA文庫。相對于ChIP-seq實驗，CUT&tag具有可重復性強、背景噪音低、起始量要求低等優(yōu)點。
Multi-CUT&Tag是利用新興的納米抗體偶聯(lián)Tn5（Nanobody-Tn5），利用納米抗體識別一抗，使得Tn5被納米抗體靶向到特定位置發(fā)揮靶向切割，將切割得到的DNA序列進一步擴增得到DNA文庫。相對于傳統(tǒng)CUT&Tag技術(shù)，Multi-CUT&Tag可以實現(xiàn)一份樣本，同時研究兩種靶標，節(jié)約樣本和時間，實驗無需二抗，減少實驗流程。
CUT&RUN是研究DNA與蛋白質(zhì)互作的新型技術(shù)，利用Mnase酶對染色質(zhì)開放區(qū)域進行切割，之后將切割得到的DNA進行建庫以獲得靶向蛋白質(zhì)互作的DNA信息。
DAP-seq是研究DNA與蛋白互作的技術(shù)，它屬于體外ChIP-seq，主要針對一些非模式物種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因體系或者過表達實驗不容易操作的樣本，本實驗的優(yōu)點是無需購買抗體即可實驗。
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CUT&Tag |
Multi-CUT&Tag |
ChIP-seq |
CUT&RUN |
DAP-seq |
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胞內(nèi)反應(yīng) |
胞內(nèi)反應(yīng) |
*胞內(nèi)反應(yīng) |
胞內(nèi)反應(yīng) |
胞外反應(yīng) |
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收集細胞，無需特殊處理 |
收集細胞，無需特殊處理 |
甲醛交聯(lián) |
收集細胞，無需特殊處理 |
提取樣本DNA進行片段化和接頭連接 |
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ConA磁珠與細胞孵育 |
ConA磁珠與細胞孵育 |
細胞破碎裂解，超聲打斷gDNA |
ConA磁珠與細胞孵育 |
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一抗二抗結(jié)合目的蛋白 |
兩種抗體同時孵育并靶向（無需二抗） |
一抗結(jié)合目的蛋白 |
一抗二抗結(jié)合目的蛋白 |
麥胚乳蛋白表達系統(tǒng)表達蛋白并在在體外與DNA進行共孵育 |
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轉(zhuǎn)座酶復合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng) |
轉(zhuǎn)座酶結(jié)合、激活反應(yīng) |
免疫沉淀 |
MNase酶復合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng) |
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磁珠回收DNA片段 |
磁珠回收DNA片段 |
洗脫，解交聯(lián)，獲得DNA片段 |
純化獲得DNA片段 |
洗脫并純化獲得DNA片段 |
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一步法PCR擴增文庫 |
一步法PCR擴增文庫 |
多步反應(yīng)：修復加A，加接頭，PCR擴增 |
多步反應(yīng)：修復加A，加接頭，PCR擴增 |
多步反應(yīng)：修復加A，加接頭，PCR擴增 |
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產(chǎn)物純化，上機測序 |
產(chǎn)物純化，上機測序 |
產(chǎn)物純化，上機測序 |
產(chǎn)物純化，上機測序 |
產(chǎn)物純化，上機測序 |
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總時長：7.5 hour |
總時長：6 hour |
總時長：3-5 Day |
總時長：1-2 Day |
總時長：1-2 Day |
圖.不同組蛋白修飾的CUT&Tag及Multi-CUT&Tag實驗結(jié)果
Multi-CUT&Tag可以實現(xiàn)一份樣本，兩種不同組蛋白修飾的研究。組蛋白修飾同時研究的數(shù)據(jù)拆分后的結(jié)果與常規(guī)單靶標研究結(jié)果一致。
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® |
12 T/ 48 T |
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Hieff NGS® Multi-CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina®Multi-CUT&Tag試劑盒（Nanobody-Tn5款） |
12 T/ 48 T |
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Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® Tn5測序接頭 |
48 T/ 192 T |
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Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V2 |
24 T/ 96 T |
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Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina® |
12413ES02 |
96×2T |
欲知后續(xù)內(nèi)容，請待下周揭曉……
