ND-2000測定出來的核酸濃度是準確的嗎？

翌圣生物核酸提取系列產品，上市前嚴選質控指標，上市后產品不良投訴率極低。但近來，遇到了部分客戶反饋“質粒提取得率低”“DNA提取產量低于其他產品”，究其根源，“NanoDrop 2000(ND-2000)”式的直接讀取待測物質濃度早已成為實驗室判定核酸濃度高低的黃金法則。然而，這可信嗎？

作為翌圣生物公眾號的老粉絲，相信你肯定有注意過我們反復推出的一篇技術干貨《qPCR實驗還在糾結cDNA濃度低？小翌帶你走出誤區(qū)》，文章得出了兩條重要結論：

1.不同品牌逆轉錄產品的cDNA濃度（ND-2000測定）相差較大，但定量實驗Ct值幾乎一致。

2.逆轉錄體系中dNTP 投入量的多少會使cDNA濃度的測定結果產生較大差異，但最終Ct值幾乎一致。

（數據引用自“qPCR實驗還在糾結cDNA濃度低？小翌帶你走出誤區(qū)”）

 

至此，我們引發(fā)了思考：ND-2000測定出來的核酸濃度是準確的嗎？

 

ND-2000式的核酸濃度測定悖論

眾所周知，ND-2000是依據任何物質在紫外可見光范圍內的特定波長下可檢測到吸光度值，諸如260nm處可檢測dsDNA、ssDNA、RNA、dNTPs；280nm處檢測蛋白質、乙醇；230nm處檢測裂解常見組分硫氰酸胍、鹽酸胍、EDTA、Triton™ X-100、Tween^® 20苯酚等。因此，“pure”dsDNA通過測定得出我們熟知的幾個數值：A260=1相當于50ng/µl；A260/280≈1.8；A260/A230≈2.0-2.2。類似地，“pure”RNA亦有類似數據。此數據被用于濃度評測和核酸純度分析。

然而，儀器廠家深知上述數據的偏差性，所以資料顯示比值僅作為樣本質量的參考指標，最佳的評測指標是后續(xù)的實驗應用。

同時，也指出比值正確的樣品，樣本質量也可能并不佳！所以：

“Pure”dsDNA is A260/A280≈1.8；A260/A230≈2.0-2.2；

But A260/A280≈1.8；A260/A230≈2.0-2.2 ≠“Pure”DNA。

在此基礎上，我們不難明白：吸光度值測定物質缺少特異性。所以，ND-2000式的核酸濃度測定屬于一個悖論！

 

 

 

打破悖論，準確定義提取產量

但下游應用是需要做核酸濃度測定和核酸質量評估以保證定性或定量的研究和分析，那么使用提取類產品應該如何進行核酸提取質量的比較呢？

1. 膠圖決定核酸質量，判定產物是否“Pure”

首先，要明白對于核酸提取產物而言，濃度與純度誰更重要？答案：純度更重要。瓊脂糖凝膠電泳圖是比較直觀的核酸純度分析方法。

表1. 購買市面兩家主流產品，提取擬南芥基因組DNA

圖1.  市面兩家主流產品，提取的擬南芥基因組DNA電泳圖

可以看出，膠圖較ND-2000的判定結果更為準確！
2. 翌圣生物提取系列產品“膠圖+下游應用測試”，保證產品競爭力

注：Y代表Yeasen產品，T代表其他品牌同類產品

總之，選取一款高質量的提取試劑盒作為實驗開始的擔保，得到的DNA/RNA足夠純，那么濃度測定也更為準確，做下游定量、定性實驗結果更有保證！

相關產品

產品貨號	產品名稱	規(guī)格	價格
19001ES50/70	MolPure® Plasmid Mini Kit 質粒小量提取試劑盒	50T/200T	183/573
19021ES50/70	MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit 無內毒素質粒小量提取試劑盒	50T/200T	515/1655
19036ES10	MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit 無內毒素質粒大量提取試劑盒	10T	1273
19101ES50/70	MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒	50T/200T	263/573
18700ES50/70	MolPure® Cell/Tissue DNA Kit 細胞/組織DNA提取試劑盒	50T/200T	433/1583
18800ES50/70	MolPure® Plant DNA Kit 植物DNA提取試劑盒	50T/200T	513/1653

HB20201202