產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品簡介
真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾可在5'端形成一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶，其由D1和D12兩個(gè)亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性（TPase）、鳥苷?；D(zhuǎn)移酶活性（GTase）和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性（N7 MTase）。牛痘病毒加帽酶參與作用下的mRNA加帽過程如下圖1所示，在mRNA 5'端添加一個(gè)7-甲基鳥嘌呤帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp），即為Cap0（圖2）。
mRNA +1位核苷酸的核糖2’位羥基也可以甲基化，產(chǎn)物稱為Cap1，人類的mRNA都具有Cap1結(jié)構(gòu)。Cap1不僅與翻譯起始有關(guān)，在針對外源RNA的先天免疫系統(tǒng)中，還可作為自身RNA的標(biāo)志。2-O-甲基轉(zhuǎn)移酶可以在mRNA +1位核苷酸的2´-OH位置處添加一個(gè)甲基基團(tuán)，最終形成最有Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA（圖3）。
該產(chǎn)品主要應(yīng)用于RNA體外轉(zhuǎn)錄之后加帽，形成具有Cap1帽子結(jié)構(gòu)的mRNA。
圖1 Cap0的形成過程
圖2 帶有Cap0結(jié)構(gòu)的mRNA
圖3 帶有Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA
產(chǎn)品信息
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貨號 |
17121ES50 / 17121ES60 / 17121ES70 |
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規(guī)格 |
50 T / 100 T / 500 T |
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
17121ES50 |
17121ES60 |
17121ES70 |
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17121-A |
10×Capping Buffer |
100μL |
200μL |
1000μL |
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17121-B |
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl) |
50μL |
100μL |
500μL |
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17121-C |
2-O-methyltransferase(50U/μl) |
50μL |
100μL |
500μL |
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17121-D |
RNase inhibitor(40U/μl) |
25μL |
50μL |
250μL |
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17121-E |
SAM（32mM） |
12.5μL |
25μL |
125μL |
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17121-F |
GTP（10mM） |
50μL |
100μL |
500μL |
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17121-G |
DEPC-H2O |
2500μL |
5000μL |
25ml |
用戶需自備材料：轉(zhuǎn)錄后的RNA、RNA純化試劑。
備注：RNA 可使用翌圣生物10623ES（T7 High Yield RNA Synthesis Kit）進(jìn)行合成。
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
酶法加帽反應(yīng)（以20μl 反應(yīng)體系為例）:
1) 取10μg RNA用 DEPC-H2O 稀釋至14 μL；
2) 將 RNA 置于 65℃加熱 5min，而后立即置于冰上 5min；
3) 依次加入以下各組分：
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組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
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Denatured RNA |
10μg |
0.5μg/μl |
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10×Capping Buffer |
2 |
1× |
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GTP(10mM) |
1 |
0.5mM |
|
SAM(32mM) |
0.5 |
0.8mM |
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RNase inhibitor(40U/μl) |
0.5 |
1U/μl |
|
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl) |
1 |
0.5U/μl |
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2-O-methyltransferase(50U/μl) |
1 |
2.5U/μl |
37℃反應(yīng)30min。
注意事項(xiàng)
- 加帽效率受RNA 5’端序列及結(jié)構(gòu)影響，因此建議在加帽反應(yīng)前，通過熱變性的方法打開RNA的二級結(jié)構(gòu)使RNA更容易加帽。一般熱變性的操作條件為65℃、5min后立即置于冰浴，但可根據(jù)5’端序列、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度以及加帽體積適當(dāng)延長熱變性時(shí)間；
- 本試劑盒中SAM濃度為32mM，如加樣體積過小，可在加帽反應(yīng)前根據(jù)使用量將32mM儲液用DEPC-H2O稀釋成8mM或更低濃度的工作液；因SAM不穩(wěn)定，稀釋過程需在冰上操作，稀釋量應(yīng)等同于使用量；不建議將儲液一次性稀釋成低濃度的工作液;
- 如僅需要制備具有Cap0帽子結(jié)構(gòu)的RNA，反應(yīng)體系中可不添加2-O-methyltransferase；
- 加帽反應(yīng)一般可在30min之內(nèi)完成，可根據(jù)RNA 5’端序列、長度以及反應(yīng)體積等調(diào)整時(shí)長。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途。
- 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
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T7 High Yield RNA Synthesis Kit |
10623ES |
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Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade (2 U/μL) |
10611ES |
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Hieff NGS® RNA Cleaner |
12602ES |
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Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit mRNA純化試劑盒 |
12603ES |
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T7 High Yield RNA Synthesis Kit for Co-transcription |
10673ES |
Ver.CN20231130
