本產(chǎn)品銜接Hieff NGS® Dual-mode RNA Library Prep Kit (Yeasen: Cat#12309ES)，替代其中的Frag/Prime buffer使用，用于RNA的片段化和一鏈cDNA合成步驟。Input RNA可以是total RNA，也可以是mRNA純化的產(chǎn)物、rRNA去除的產(chǎn)物等。由于在Cat#12309ES中直接使用1×Frag/Prime Buffer去洗脫mRNA純化或rRNA去除操作中所得的RNA，沒有額外的體積用于添加含RNA的溶液。若Input RNA已經(jīng)溶解于Nuclease free ddH₂O中，可選擇本產(chǎn)品進(jìn)行RNA片段化或一鏈cDNA合成反應(yīng)。

 

組分信息

組分編號(hào)	組分名稱	13487ES08	13487ES24	13487ES96	13487ES98
13487-A	4 × Frag/Prime Buffer	32 μL	96 μL	384 μL	4 mL

 

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

當(dāng)Input RNA不需要片段化處理時(shí)，請選擇方案A；當(dāng)Input RNA需要片段化處理時(shí)，請選擇方案B。

A1. 若Input RNA無需片段化處理，可結(jié)合Cat#12309ES試劑，按照表1直接配制第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系。

表1 直接進(jìn)行第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Input RNA	13
4×Frag/Prime Buffer	4
Strand Specificity Reagent	6
1st Strand Enzyme Mix	2
Total	25

A2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底，按照表2反應(yīng)程序于PCR儀中進(jìn)行一鏈合成反應(yīng)。一鏈合成產(chǎn)物可銜接Cat#12309ES進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

 

表2 第一鏈cDNA合成反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋 105°C	On
25 °C	10 min
42°C	15 min
70°C	15 min
4°C	Hold

B1. 若Input RNA需要進(jìn)行片段化處理，可按照3配制片段化體系進(jìn)行RNA片段化。

表3 片段化反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Input RNA	13
4×Frag/Prime Buffer	4
Total	17

B2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底，根據(jù)Input RNA的完整度和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，參?/font>Cat#12309ES說明書設(shè)置合適的片段化條件。

B3. 片段化產(chǎn)物進(jìn)行一鏈cDNA合成，按照表4配制一鏈cDNA合成反應(yīng)體系。

表4 第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Fragmented RNA	17
Strand Specificity Reagent	6
1st Strand Enzyme Mix	2
Total	25

B4. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底，按照表2反應(yīng)程序于PCR儀中進(jìn)行一鏈合成反應(yīng)。一鏈合成產(chǎn)物可銜接Cat#12309ES進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

 

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 請使用無RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM 高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

4.  Input RNA請溶于Nuclease free ddH₂O，避免Mg²⁺的存在干擾片段化效果；Input RNA最大投入體積為13 μL，在進(jìn)行洗脫時(shí)請注意洗脫體積的選擇。