本產(chǎn)品適用于多重PCR實驗。4×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen以熱啟動多重Taq酶制劑與4×擴增緩沖液為組分配置成預(yù)混液。本預(yù)混液可快速便捷地用于多重PCR反應(yīng)，擴增子GC含量25-75%范圍內(nèi)可以有效擴增。具備高均一性、高特異性和高靈敏度的特點，同時嚴控背景菌。本試劑可兼容30~100對以內(nèi)不同大小片段的多重擴增，也可用于進行數(shù)千重及以上擴增子的捕獲?？蓱?yīng)用病原微生物檢測、環(huán)境微生物鑒定、食品安全檢測等多個應(yīng)用場景。

 

運輸與保存方式

冰袋運輸。-25 ~ -15℃儲存，有效期2年。

 

實驗流程

1. 推薦反應(yīng)體系：

一輪反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	終濃度
4×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen	7.5	1×
Primer mix	x	0.02 μM-0.5 μM
模板DNA	x	1 ng-400 ng
無菌超純水	x	-
總體積	To30

【注】

1上表中DNA量和引物濃度均為推薦用量和濃度，可根據(jù)具體實驗情況進行調(diào)整最適濃度。

2）參考建議：每條引物的濃度可在0.02 μM-0.5 μM范圍內(nèi)進行調(diào)整。

3）預(yù)混液中已經(jīng)包含擴增所需要的酶、dNTP、鹽離子等，無需額外添加。

二輪反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	終濃度
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen（Cat.13581）	15	1×
Primer Index mix	4（~6 pmol）
一輪純化產(chǎn)物	11
無菌超純水	x	-
總體積	To 30

 

2. 推薦反應(yīng)程序：

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	3 min	1
變性	95℃	30 sec	X
退火	60℃	30 sec
延伸	72℃	30 sec
終延伸	72℃	3 min
暫存	4℃	-	1

【注】

1. 退火時間可以根據(jù)Panel種類不同，進行適當延長，或者是梯度退火，比如64℃ 1 min，60℃ 1 min;
2. 延伸時間以最長片段為準。延伸時間太長會導(dǎo)致非特異性擴增增多，可通過縮短延伸時間來提高擴增特異性，延伸時間不少于30 sec。 
3. 針對模板含量較低的樣本，可通過增加循環(huán)數(shù)提高擴增產(chǎn)出。
4. Panel引物重數(shù)較多時可增加退火時間，調(diào)整梯度退火程序，或者根據(jù)已有Panel的合適的PCR反應(yīng)程序進行測試。

3. 循環(huán)數(shù)推薦：

單管引物重數(shù)	推薦循環(huán)數(shù) （10 ng gDNA ）		退火延伸時間
	一輪	二輪
10-50	10~28	18~28	30 s~2 min
50-200	10~28	16~28	30 s~2 min
200-800	10~28	14~28	30 s~2 min
800以上	10~28	12~28	30 s~4 min

【注】

上表是基于10 ng gDNA進行的一輪及二輪循環(huán)數(shù)的推薦；當投入量大于10 ng，二輪的相應(yīng)的循環(huán)數(shù)可以減少；當投入量小于10 ng，一，二輪的相應(yīng)的循環(huán)數(shù)要相應(yīng)的增加。

4. 多重擴增引物純化

一輪 PCR 產(chǎn)物 0.9×磁珠純化

1) 準備工作：將 Hieff NGS^® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。

2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3) 吸取 27 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產(chǎn)物中，室溫孵育 5 min。

4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。

5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6) 重復(fù)步驟 5，總計漂洗兩次。

7) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過 5min）。

8) 直接加入 11 μL ddH₂O，將 PCR 管從磁力架中取出，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。進入下一步反應(yīng)。

二輪 PCR 產(chǎn)物 0.9×磁珠純化

1) 準備工作：將 Hieff NGS^® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。

2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3) 吸取 27 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產(chǎn)物中，室溫孵育 5 min。

4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。

5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6) 重復(fù)步驟 5，總計漂洗兩次。

7) 磁珠晾干后，將PCR管從磁力架上取下，加入30 μL Nuclease-free ddH₂O覆蓋磁珠，使用移液器吹打混勻。室溫孵育2 min。如果磁珠干燥開裂，適當延長孵育時間。

8）將PCR管短暫離心收集后置于磁力架中，分離磁珠和液體直到溶液澄清(約5 min)。 小心吸取25 μL上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，繼續(xù)進行下一步反應(yīng)。

 

HB230308